一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法

摘要

本发明公开了一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，按照如下步骤完成：(1)柑橘全爪螨若螨的饲养；(2)对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理；(3)测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况，对RNA干扰效果进行评价。该方法设计新颖、合理，建立的RNA干扰导致柑橘全爪螨无法完成正常蜕皮而死亡，从而达到防治柑橘全爪螨的目的，有利于减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种柑橘领域，具体地说，特别涉及一种柑橘全爪螨若螨的 RNA干扰方法。

背景技术

柑橘全爪螨是一种世界性柑橘害螨，对柑橘产量和品质影响较大。目前化 学防治仍是控制柑橘全爪螨的重要措施，化学农药施用不当，不仅影响果品安 全，同时还会导致严重的抗性药，害螨抗药性直接制约了农药的使用年限、范 围及防治效果。RNA干扰(RNA interference，RNAi)是一种非常具有前途的 控制害虫的新方法，可为生产上更好地防治影响粮食及经济作物产量的害虫提 供新的途径，该技术是传统病虫害防治技术的新突破，具有广阔的应用前景， 目前许多重要害虫特异的RNA干扰技术已经构建，但用于柑橘全爪螨特别是 其若螨的RNA干扰技术还没建立。因此，有必要针对柑橘全爪螨建立相应的 RNA干扰技术，进而为其防治提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柑橘全爪螨若螨的RNA干扰方法，基于柑橘 全爪螨几丁质基因，合成特异的dsRNA，从而将柑橘全爪螨几丁质酶基因沉默， 使柑橘全爪螨无法完成正常的生长发育，最终实现柑橘全爪螨的控制。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：一种柑橘全爪螨若螨的RNA干 扰方法，其特征在于：按照如下步骤完成：

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养：

在培养皿内制成梯级滤纸隔离台，取洗净的柑橘叶片，将叶面向下置于滤 纸隔离台上，用湿脱脂棉条压住叶沿，在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h 后去除雌成螨，将雌成螨产的卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为25±1℃， 相对湿度为70％-80％，光周期为L∶D=(14∶10)h连续培养5-7天，得到柑橘 全爪螨若螨；

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理：

将孵化的若螨挑在新的叶片上，在处理好的叶片上滴一滴dsRNA溶液，用0 号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出，将浸过液的若螨置于恒温光照 培养箱中控制温度为25±1℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培 养；其中步骤(2)所用dsRNA溶液为shRNA1溶液，其中shRNA1的碱基序列为： shRNA1：5′-GATCGTCTGTTATTTCACC-3′    SEQ NO 1 shRNA1溶液浓度为2.0-6.0μg/ml；

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA 干扰效果。

采用上述技术方案，本发明通过处理柑橘全爪螨若螨，将柑橘全爪螨若螨 与dsRNA接触后，观察RNAi对柑橘全爪螨若螨的蜕皮情况，从而评价RNA 干扰对柑橘全爪螨的作用效果。该方法为柑橘全爪螨的控制提供了新的策略， 同时也为减少化学农药使用提供了新的措施，因而具有极其广阔的应用前景。

在上述技术方案中，为了更好的培育柑橘全爪螨，所述步骤(1)中，梯级滤 纸隔离台通过取直径为9cm的培养皿铺上0.7cm厚的海绵，海绵上铺直径略小 于海绵的滤纸，加水至滤纸边缘，制成梯级水隔离台。

在上述技术方案中，为了柑橘全爪螨提供够足够的食物，所述步骤(1)中， 柑橘叶片为刚采摘完整、生长旺盛的柑橘叶片。

在上述技术方案中，为了RNA干扰效果更好，所述步骤(2)中，dsRNA是 通过几丁质酶和绿色荧光蛋白的cDNA序列，设计合成双链dsRNA。

有益效果：该方法设计新颖、合理，本方法将柑橘全爪螨的生长发育相关 基因沉默，使该螨无法完成正常的生长发育，达到防治的效果，进而对柑橘全 爪螨的控制发挥重要作用，同时减少化学农药使用量，因而具有极其广阔的市 场前景。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明：

实施例1

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺 直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、 生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿 脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨， 所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光 周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光照=(14∶10)h，连续培养5天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将若螨挑在新的叶片上，通过在柑橘全爪螨转录组数据中发现几丁质酶基 因上存在SNP(single nucleotide polymorphism)位点，SNP即单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism)是由于单个核苷酸的改变而导致的核酸序列 多态性，经真实性检测发现确实存在，为检测几丁质酶基因与抗性之间的关系， 以几丁质酶为靶标基因进行RNA干扰检测该基因沉默后对柑橘全爪螨生命活 动的影响，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA序列，设计合成 dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为2.0μg/ml的dsRNAshRNA1溶液，用0 号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。将处理好的若螨置于恒温 光照培养箱中，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10) h，即为长光照：短光照=(14∶10)h，培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA 干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片上放置100 头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培养，控制温 度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光 照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部发育完全为 止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅 头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为 35％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出 现致死性表型。

实施例2

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺 直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、 生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿 脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨， 所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为26℃，相对湿度为70％-80％，光 周期L∶D=(14∶10)h连续培养7天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将若螨挑在新的叶片上，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的cDNA 序列，设计合成dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为6.0μg/ml的 dsRNAshRNA1溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。 将处理好的若螨置于恒温光照培养箱中，控制温度为26℃，相对湿度为 70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA 干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片上放置100 头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培养，控制温 度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长光照：短光 照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部发育完全为 止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅 头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为 25％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出 现致死性表型。

实施例3

(1)、柑橘全爪螨若螨的饲养

将径为9cm培养皿洗净擦干，在培养皿上铺0.7cm厚的海绵，海绵上铺 直径略小于海绵的滤纸，加水至与滤纸相平，制成梯级水隔离台。摘取完整、 生长旺盛的柑橘叶片，浸水洗净，叶面向下置于梯级水隔离台的滤纸上，用湿 脱脂棉条压住叶沿。在叶片上接种橘全爪螨雌成螨，产卵24h后去除雌成螨， 所产卵置于恒温光照培养箱中，控制温度为24℃，相对湿度为70％-80％，光 周期L∶D=(14∶10)h连续培养6天。

(2)、对柑橘全爪螨若螨进行dsRNA溶液处理

将孵化的若螨挑在新的叶片上，根据几丁质酶和绿色荧光蛋白(GFP)的 cDNA序列，设计合成dsRNA，在每片叶片上滴一滴浓度为4.0μg/ml的 dsRNAshRNA1溶液，用0号毛笔将若螨逐个轻轻挑于液滴上，浸5s后挑出。 将处理好的若螨置于恒温光照培养箱中，控制温度为24℃，相对湿度为 70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h培养24h，以清水处理为对照组。

(3)、测定处理后柑橘全爪螨若螨蜕皮及存活情况

记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评价RNA 干扰效果。记录喂食dsRNA溶液后的柑橘全爪螨若螨的蜕皮及存活情况，评 价RNA干扰效果。将处理后的柑橘全爪螨若螨放在在新鲜叶片上，每片叶片 上放置100头处理后的若螨，每个处理重复3次。将处理放于光照培养箱中培 养，控制温度为25℃，相对湿度为70％-80％，光周期L∶D=(14∶10)h，即为长 光照：短光照=(14∶10)h。每天用双目镜观察它的发育情况，直至若螨全部 发育完全为止，另以未处理dsRNA溶液的柑橘全爪螨若螨为对照。

处理结果发现喂食dsRNA后的柑橘全爪螨若螨会有致死性的表型，即仅 头部旧表皮开裂，其余部分仍包裹在旧表皮中。其中该致死表型的致死率为 30％，而未处理的柑橘全爪螨若螨可以完成包括蜕皮在内的完整发育史，未出 现致死性表型。