提高衣藻产氢量的培养基及其制备方法

摘要

本发明公开了一种提高衣藻衣藻产氢量的培养基及其制备方法，本发明提供的培养基，由如下13种物质组成：NH

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种提高衣藻衣藻产氢量的培养基及其制备 方法。

背景技术

由于矿物资源的日益枯竭，寻找清洁的替代能源已成为一项迫切的课题。氢是宇 宙间最简单同时也是最为丰富的元素，它的热值高达118.4kJ/g，燃烧后只生成水， 被普遍认为是一种最有吸引力的替代能源。新的产氢方法，特别是那些能利用可再生 能源，大量生产的产氢方法倍受注目。

藻类光合制氢是微藻利用太阳能裂解水释放氢气的生物过程，是实现氢能可持续 生产的重要途径之一。为了尽可能提高产氢量，研究人员从不同角度出发，深入探讨 提高产氢量的可能性：如提高氢酶耐氧性、遗传改造及寻找高产氢藻种等。

衣藻是人们研究藻类产氢的常用藻种，目前，人们常用的为缺硫环境的放氢体系， 大多数的研究也都基于此。缺硫体系中含有除硫元素以外的C、H、O、N、P、K等大量 元素及少量微量元素，通过缺硫厌氧达到产氢的目的。尽管在此培养条件下，能得到 较多的氢气，但仍不能达到实际应用的要求。另外，培养基配置所需药品也在衣藻产 氢成本中占有一定比例。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种培养衣藻产氢的培养基。

本发明提供的培养基，由如下13种物质组成：NH₄Cl、MgCl₂·6H₂O、K₂HPO₄、KH₂PO₄、 Tris碱、H₃BO₄、Zn Cl₂、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、Cu Cl₂·2H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、 FeCl₂·4H₂O和冰乙酸，

所述NH₄Cl、MgCl₂·6H₂O、K₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris碱、H₃BO₄、Zn Cl₂、MnCl₂·4H₂O、 CoCl₂·6H₂O、Cu Cl₂·2H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、FeCl₂·4H₂O和冰乙酸的配比为 (0.35-0.45)g∶(0.08-0.15)g∶0.108g∶0.056g∶(2.2-2.5)g∶0.0114g∶0.0105g∶ 0.00506g∶0.00161g∶0.001072g∶0.0011g∶0.003568g∶(0.8-1.1)ml。

所述NH₄Cl、MgCl₂·6H₂O、K₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris碱、H₃BO₄、Zn Cl₂、MnCl₂·4H₂O、 CoCl₂·6H₂O、Cu Cl₂·2H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、FeCl₂·4H₂O和冰乙酸的配比为(0.35、 0.4或0.45)g∶(0.08、0.1或0.15)g∶0.108g∶0.056g∶(2.2、2.423或2.5)g∶ 0.0114g∶0.0105g∶0.00506g∶0.00161g∶0.001072g∶0.0011g∶0.003568g∶(0.8、 1或1.1)ml。

所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

本发明的另一个目的是提供一种培养衣藻产氢的培养基。

本发明提供的培养基，由溶质和溶剂组成，所述溶质由如下13种物质组成：NH₄Cl、 MgCl₂·6H₂O、K₂HPO₄、KH₂PO₄、Tris碱、H₃BO₄、ZnCl₂、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、Cu Cl₂·2H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、FeCl₂·4H₂O和冰乙酸组成，

所述NH₄Cl在所述培养基中的终浓度为0.35g/l-0.45g/l；

所述MgCl₂·6H₂O在所述培养基中的终浓度为0.08g/l-0.15g/l；

所述K₂HPO₄在所述培养基中的终浓度为0.108g/l；

所述KH₂PO₄在所述培养基中的终浓度为0.056g/l；

所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2.2g/l-2.5g/l；

所述H₃BO₄在所述培养基中的终浓度为0.0114g/l；

所述ZnCl₂在所述培养基中的终浓度为0.0105g/l；

所述MnCl₂·4H₂O在所述培养基中的终浓度为0.00506g/l；

所述CoCl₂·6H₂O在所述培养基中的终浓度为0.00161g/l；

所述CuCl₂·2H₂O在所述培养基中的终浓度为0.001072g/l；

所述(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O在所述培养基中的终浓度为0.0011g/l；

所述FeCl₂·4H₂O在所述培养基中的终浓度为0.003568g/l；

所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为0.8ml/l-1.1ml/l；

所述溶剂为水。

所述NH₄Cl在所述培养基中的终浓度为0.35g/l、0.4g/l或0.45g/l；

所述MgCl₂·6H₂O在所述培养基中的终浓度为0.08g/l、0.1g/l或0.15g/l；

所述Tris碱在所述培养基中的终浓度为2.2g/l、2.423g/l或2.5g/l；

所述冰乙酸在所述培养基中的终浓度为0.8ml/l、1ml/l或1.1ml/l。

所述培养基的pH值为6.8-7.3，所述培养基的pH值具体为6.8、7或7.3；

所述衣藻为莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。

本发明的第三个目的是提供一种培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将所述13种物质按照所述配比混合，得到所 述培养基。

本发明的第四个目的是提供一种培养基的制备方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将所述溶质中的13种物质均溶于水达到所 述终浓度，得到所述培养基。

所述的培养基在促进衣藻产氢中的应用；所述衣藻具体为莱茵衣藻 (Chlamydomonas reinhardtii)。

本发明的第五个目的是提供一种利用衣藻制备氢气的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将衣藻在权利要求1-8中任一所述的培养基 中培养，收集培养产物，即得到氢气；

所述培养温度为25℃，所述培养时间为7天(168小时左右)；所述培养的光照 强度为200μEs^-1m^-2。

上述莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)均为莱茵衣藻(Chlamydomonas  reinhardtii)CC400。

本发明的实验证明，本发明通过对现有放氢培养基配方(缺硫TAP培养液)进行 优化后，发现在缺硫缺钙TAP培养液中，衣藻CC400的产氢量比现有缺硫体系下提高 三分之二左右，而且减少了一种培养基组成，降低了成本。同时，由于在该缺硫培养 基配方中，钙元素仅存在CaCl₂·2H₂O中，因此可以较为方便的通过除去该化合物而控 制实现缺硫缺钙的环境，操作方便。总之，与原有的衣藻产氢培养体系相比，本发明 中的改进体系不但可以节约药品用量，而且放氢量也有所提高，这对于实现藻类低成 本产氢的目标，又向前迈进了一步。

附图说明

图1为产氢量的结果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、藻种CC400产氢检测

一、材料

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)，藻种CC400从杜克大学藻种库莱茵衣藻 (Chlamy center，http://www.chlamy.org/)购买；

二、培养基(下述培养基中的各种组分均可从商业途径购买)

1、正常TAP培养液：NH₄Cl 0.4g/L；MgSO₄·7H₂O 0.1g/L；CaCl₂·2H₂O 0.05 g/L；K₂HPO₄ 0.108g/L；KH₂PO₄ 0.056g/L；Tris碱2.423g/L；亨特微量元素(Hunter’s  trace elements)1ml/L，冰乙酸1ml/L，其余为水。

亨特微量元素(Hunter’s trace elements)：H₃BO₄ 11.4g/L，ZnSO₄·7H₂O 22.0 g/L，MnCl₂·4H₂O 5.06g/L，CoCl₂·6H₂O 1.61g/L，CuSO₄·5H₂O 1.57g/L， (NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 1.10g/L，FeSO₄·7H₂O 4.99g/L，其余为水。

固体TAP培养基：在正常TAP培养液中加1.5％的琼脂粉。

培养基的pH值均为7。

2、缺硫TAP培养液(g/L)：

将正常培养液中的硫化物以等摩尔换成相应的氯化物：MgSO₄·7H₂O(MgCl₂·6H₂O)、 ZnSO₄·7H₂O(Zn Cl₂)、CuSO₄·5H₂O(CuCl₂·2H₂O)、FeSO₄·7H₂O(FeCl₂·4H₂O)，括号 中为替换后的对应的氯化物；

具体如下：

缺硫TAP培养液由如下物质组成：NH₄Cl 0.4g/L；MgCl₂·6H₂O 0.1g/L；CaCl₂·2H₂O 0.05g/L；K₂HPO₄ 0.108g/L；KH₂PO₄ 0.056g/L；Tris碱2.423g/L；H₂BO₄ 0.0114g/L、 Zn Cl₂ 0.0105g/L、MnCl₂·4H₂O 0.00506g/L、CoCl₂·6H₂O 0.00161g/L、Cu Cl₂·2H₂O 0.001072g/L、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O 0.0011g/L、FeCl₂·4H₂O 0.003568g/L，冰乙酸 1ml/L，其余为水。培养基的pH值均为7。

3、缺钙TAP培养液(g/L)：将正常TAP培养液中的CaCl₂·2H₂O除去；培养基的 pH值均为7。

4、缺硫缺钙TAP培养液(g/L)：将正常TAP培养液中的硫化物以等摩尔换成相应 的氯化物，同时除去正常培养液中的CaCl₂·2H₂O。

具体如下：

缺硫缺钙TAP培养液1按照如下方法制备：将NH₄Cl、MgCl₂·6H₂O、K₂HPO₄、KH₂PO₄、 Tris碱、H₃BO₄、ZnCl₂、MnCl₂·4H₂O、CoCl₂·6H₂O、Cu Cl₂·2H₂O、(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、 FeCl₂·4H₂O、冰乙酸和水混合，NH₄Cl在培养基中的终浓度为0.4g/l；MgCl₂·6H₂O 在培养基中的终浓度为0.08g/；K₂HPO₄在培养基中的终浓度为0.108g/l；KH₂PO₄在 培养基中的终浓度为0.056g/l；Tris碱在培养基中的终浓度为2.423g/l；H₃BO₄在培 养基中的终浓度为0.0114g/l；ZnCl₂在培养基中的终浓度为0.0105g/l；MnCl₂·4H₂O 在培养基中的终浓度为0.00506g/l；CoCl₂·6H₂O在培养基中的终浓度为0.00161g/l； CuCl₂·2H₂O在培养基中的终浓度为0.001072g/l；(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O在培养基中的终 浓度为0.0011g/l；FeCl₂·4H₂O在培养基中的终浓度为0.003568g/l；冰乙酸在培养 基中的终浓度为1ml/l；培养基的pH值为7；

缺硫缺钙TAP培养液2按照如下方法制备：与缺硫缺钙TAP培养液1基本相同， 不同的是NH₄Cl在培养基中的终浓度为0.35g/l；MgCl₂·6H₂O在培养基中的终浓度为 0.1g/l；Tris碱在培养基中的终浓度为2.2g/l；冰乙酸在培养基中的终浓度为0.8 ml/l；培养基的pH值为6.8；

缺硫缺钙TAP培养液3按照如下方法制备：与缺硫缺钙TAP培养液1基本相同， 不同的是：NH₄Cl在培养基中的终浓度为0.45g/l；MgCl₂·6H₂O在培养基中的终浓度为 0.15g/l；Tris碱在培养基中的终浓度为2.5g/l；冰乙酸在培养基中的终浓度为 1.1ml/l，培养基的pH值为7.3。

二、衣藻放氢量的测定方法

1、衣藻预培养

用TAP固体培养基培养(25℃，200μEs^-1m^-2)莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) CC400。固体培养时，将单克隆转到TAP固体培养基上划线培养。

配制TAP液体培养液，121℃高压灭菌20分钟，待培养液温度降到室温(25℃) 后，用接种针从固体培养基上挑取莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)CC400单 克隆到液体TAP培养液中，置于恒温光照培养箱中的摇床上连续光照培养(25℃， 60rpm，200μEs^-1m^-2)，悬浮培养CC400衣藻细胞，培养约两天(48小时左右)，处于 指数生长期。

2、衣藻培养及放氢量的测定

①液体培养：将步骤1中处于指数生长期的CC400衣藻细胞接到盛150ml正常TAP 培养液的三角瓶中，当OD₇₅₀值达到1.5时，再将其转到已加入磁转子的500ml正常TAP 培养液中。

②待OD₇₅₀值达到1.5左右时，25℃，2500rpm，离心5分钟。

③倒掉上清液，将得到的细胞分成三组，分别用缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养 液、缺硫缺钙TAP培养液漂洗细胞两次。

④将上述3组漂洗过的细胞分别用20ml缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液、缺硫 缺钙TAP培养液1分别重悬细胞。

⑤每组分别取20μl悬浮细胞，加入980μl对应的培养液(缺硫TAP培养液、缺 钙TAP培养液或缺硫缺钙TAP培养液1)，再加入4ml丙酮，混匀，5000rpm，离心5 分钟。

⑥分别收取三组离心后的上清液，测定663nm和645nm处的吸光值，根据下面的 公式计算总叶绿素含量(Chl(a+b))：

Chl(a+b)＝8.02×OD₆₆₃+20.21×OD₆₄₅

⑦分别采用3个100ml放氢瓶，培养体系为90ml的放氢瓶，按照上述⑥的方法计 算最终叶绿素浓度达到25μg/ml所需的④步骤中的细胞原液体积，分别加入④步骤得 到的三组重悬细胞，用对应的培养液(缺硫TAP培养液、缺钙TAP培养液或缺硫缺钙 TAP培养液1)补足到90ml，得到缺硫TAP培养液组、缺钙TAP培养液组和缺硫缺钙 TAP培养液1组。

⑧用石蜡封住三组的瓶口，以防止气体外漏。

⑨分别将三组放氢瓶置于25℃，200μEs^-1m^-2培养箱中的磁力搅拌器上连续光照培 养7天，分别取不同的时间点测定放氢量。采用SHIMADZU GC-2014气相色谱测定氢气 含量，载气为氮气。测定时用250ul注射器吸取放氢瓶气体部分100ul左右，注入进 样孔，甲烷外标法计算气体体积。

实验重复三次，结果取平均值。

结果如图1所示(产氢量为在培养7天得到)，其中，CC400-Ca为缺钙TAP培养 液组，CC400-S为缺硫TAP培养液组，CC400-S-Ca为缺硫缺钙TAP培养液1组，

CC400-Ca的产氢量为0.50±0.08ml/L，CC400-S的产氢量为125.97±11.89ml/L， CC400-S-Ca的产氢量为203.94±18.48ml/L。

从上述可以看出，通过对现有放氢培养基配方(缺硫TAP培养液)进行优化后， 发现在缺硫缺钙TAP培养液中，衣藻CC400的产氢量比现有缺硫体系下提高三分之二 左右，而且减少了一种培养基组成，降低了成本。同时，由于在该缺硫培养基配方中， 钙元素仅存在CaCl₂·2H₂O中，因此可以较为方便的通过除去该化合物而控制实现缺硫 缺钙的环境，操作方便。

采用同样的方法检测缺硫缺钙TAP培养液2和缺硫缺钙TAP培养液3，结果与缺 硫缺钙TAP培养液1无显著差异。