不含白蛋白的肉毒杆菌毒素制剂

摘要

本发明涉及经稳定而不使用任何蛋白质性质的赋形剂的肉毒杆菌毒素制剂。本发明还涉及制备和使用此类肉毒杆菌毒素制剂的方法。

说明书

本申请要求对2009年6月25日提交的美国临时专利申请第 61/220,433号(将该申请的内容通过引用全文并入本文)的优先权。

发明领域

本发明涉及包含肉毒杆菌毒素(botulinum toxin)的药物制剂。具体 地，本发明涉及通过非蛋白质性质的赋形剂稳定的肉毒杆菌毒素制剂。

发明背景

肉毒杆菌毒素(也称为肉毒毒素或肉毒杆菌神经毒素)是由肉毒梭菌 (Clostridium botulinum)产生的神经毒素。肉毒杆菌毒素通过阻止乙酰 胆碱穿过神经肌肉接头(neuromuscular junction)的突触传递或释放来 产生肌肉麻痹。肉毒杆菌毒素的作用基本上阻断了通常可引起肌肉痉挛 或收缩的信号，从而导致麻痹。

存在8种天然存在的血清学相关的肉毒杆菌毒素，已知其中的7种 引起麻痹(即，肉毒杆菌神经毒素血清型A、B、C、D、E、F和G)。这些 血清型的每一种通过利用类型特异性抗体的中和作用来区别。然而，对 于所有7种活性肉毒杆菌毒素，肉毒杆菌毒素蛋白分子的分子量为约150 kD。当由肉毒梭菌释放时，肉毒杆菌毒素存在于包含150kD肉毒杆菌毒 素蛋白分子和结合的非毒素蛋白的复合物中。复合物的总大小可发生变 化。例如，肉毒杆菌毒素A型复合物可由肉毒梭菌产生为900kD、500kD 和300kD复合物。肉毒杆菌毒素B型和C型复合物只产生为700kD或 500kD复合物。肉毒杆菌毒素D型复合物产生为300kD和500kD复合 物。肉毒杆菌毒素E型和F型复合物只产生为300kD复合物。所述复合 物据认为包含非毒素血凝素蛋白以及非毒素和非毒性非血凝素蛋白。这 两种非毒素蛋白(其和肉毒杆菌毒素分子一起构成相关神经毒素复合物) 据认为为肉毒杆菌毒素分子提供抗变性的稳定性和当毒素被摄入时提供 抗消化性酸的保护作用。

虽然肉毒杆菌毒素是已知对于人最致命的天然存在的毒素，但其已 广泛地用作治疗剂和美容剂。例如，在1986年，使用A型肉毒杆菌毒素 来治疗眉间区域的运动相关的皱纹的可行性首次得到Schantz和Scott， in Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，N.Y.：Academic  Press，143-150(1981)的证实。A型肉毒杆菌毒素用于治疗皱纹的用途 公布于1992年(Schantz和Scott，in Lewis G.E.(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum，N.Y.：Academic Press，143-150(1981))，并 且到了1994年，脸上其他运动相关的皱纹可用A型肉毒杆菌毒素来治疗 (Scott，Ophthalmol，87：1044-1049(1980))。多年来，对美容肉毒杆 菌毒素治疗的需要稳定地增加，在美国目前肉毒杆菌毒素的年销售额每 年超过10亿美元。

制造商业肉毒杆菌毒素制剂的一个挑战是稳定肉毒杆菌毒素。像许 多蛋白质一样，肉毒杆菌毒素可被许多环境因素例如热、碱性条件、机 械剪切力或与反应表面或物质的接触降解或变性。此外，稳定商业制剂 中的肉毒杆菌毒素的困难因毒素的极端毒性而加大，所述极端毒性只允 许极少量毒素用于治疗目的。如果肉毒杆菌毒素制剂未被适当地稳定， 那么极少量的肉毒杆菌毒素可能经历不想要的反应和/或粘附至其贮存 容器的内表面，从而导致不可接受的肉毒杆菌毒素或活性的损失。

通常以冻干的(即冷冻干燥的)或真空干燥的粉剂分配商业肉毒杆菌 毒素制剂，以防止降解和使肉毒杆菌毒素制剂更易于操作和降低运输费 用。在使用之前，用液体载体例如水或盐水溶液重建肉毒杆菌毒素粉末 制剂。例如，一种商购可得的肉毒杆菌毒素制剂在商标BOTOX(Allergan， Inc.，Irvine，Calif.)下出售。以贮存在单独的小瓶中的真空干燥的粉 剂分配BOTOX制剂，每一个小瓶装有约100个单位(U)的肉毒梭菌毒素A 型复合物、0.5毫克人血清白蛋白和0.9毫克氯化钠。已报导，必须在 -10℃或更低的温度下贮存商业肉毒杆菌毒素制剂以在一年贮存期限内 维持标记的效力。

在肉毒杆菌毒素的商业制剂中，通常加入人血清白蛋白作为填充载 体(bulk carrier)和稳定剂。通常，白蛋白可通过一个或多个下列机制 稳定治疗性蛋白质(例如，肉毒杆菌毒素)：(1)减少治疗性蛋白质至贮存 或分配容器的内表面的粘附，所述容器包括玻璃器具、贮存瓶以及用于 注射药物组合物的注射器；和(2)减少治疗性蛋白质的变性，特别是在重 建以制备治疗性蛋白质的溶液后。人血清白蛋白具有呈现最小的免疫原 性的额外有利方面，这减少了人患者产生抗肉毒杆菌毒素制剂的抗体的 可能性。

虽然人血清白蛋白已被采用为商业肉毒杆菌毒素制剂的稳定剂，但 仍然存在与该方法相关的重大问题。一个严重的问题是，白蛋白来源于 血液，从而易于携带血液传播的病原体或感染剂。例如，人血清白蛋白 可携带人免疫缺陷病毒(HIV)。白蛋白也可携带朊病毒，其为负责引起称 为克-雅二氏病(Creutzfeldt-Jacob disease)的神经退行性障碍的蛋白 质性质的感染剂。朊病毒在脑中引起蛋白质的错误折叠，从而通常在症 状开始发作后数月的时间跨度内导致痴呆、记忆丧失、说话障碍、运动 协调的丧失以及死亡。

用非蛋白质性质的稳定剂替代人血清白蛋白的尝试通常遭遇困难。 非蛋白质性质的聚合物可对肉毒杆菌毒素起反应或可包含降解和/或使 肉毒杆菌毒素变性的反应性杂质。例如，一些研究已使用泊洛沙姆作为 肉毒杆菌毒素的非蛋白质性质的稳定化合物。然而，这些研究报导，重 建的泊洛沙姆稳定的肉毒杆菌毒素制剂显示低肉毒杆菌毒素活性，这表 明泊洛沙姆赋形剂不能适当地稳定肉毒杆菌毒素，和/或诱导了不想要的 降解反应发生。

因此，高度期望具有稳定的、但无蛋白质性质的赋形剂，特别是无 任何基于动物蛋白质的赋形剂的肉毒杆菌毒素制剂。此外，高度期望具 有本身不与肉毒杆菌毒素反应的非蛋白质性质的稳定赋形剂。

发明概述

在一个方面，本发明涉及通过非蛋白质性质的赋形剂稳定的肉毒杆 菌毒素制剂。具体地，在优选实施方案中，本发明涉及经稳定的但无白 蛋白或其他动物蛋白质来源的赋形剂的肉毒杆菌毒素制剂。

本发明的一个方面提供包含肉毒杆菌毒素、非还原性二糖或非还原 性三糖、非离子型表面活性剂和能够使pH维持在4.5至6.5之间的生理 上相容的缓冲剂的液体组合物。液体组合物中的非还原性糖的浓度在10％ 至40％(w/v)的范围内并且非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％ (w/v)的范围内。

本发明的另一个方面通过干燥上述液体组合物而提供粉末组合物。

本发明还提供了用于稳定肉毒杆菌毒素制剂的方法。所述方法包括 组合肉毒杆菌毒素、非还原性二糖或非还原性三糖、非离子型表面活性 剂和能够使pH维持在4.5至6.5的生理上相容的缓冲剂成分以形成液体 组合物。液体组合物中的非还原性糖的浓度在10％至40％(w/v)的范围内 并且非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内。任选 地，所述方法还包括干燥液体组合物以产生稳定的粉末组合物。

本发明的另一个方面提供包含肉毒杆菌毒素、非还原性二糖或非还 原性三糖、非离子型表面活性剂、填充剂(bulking agent)和生理上相容 的缓冲剂的液体组合物。在这些实施方案中，非还原性二糖成分的浓度 在0.50至3.0％(w/v)的范围内，填充剂的浓度在1.5％至7.5％的范围内， 非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内；并且组合 物的pH在4.5至6.5的范围内。此外，选择非还原性二糖或非还原性三 糖的量(相对于填充剂的量)以便当干燥液体组合物时填充剂不结晶。本 发明还明确地涉及通过干燥所述液体组合物而制备的粉末制剂。

本发明还提供了用于稳定肉毒杆菌毒素制剂的方法，包括组合肉毒 杆菌毒素、非还原性二糖或非还原性三糖、非离子型表面活性剂、填充 剂和生理上相容的缓冲剂以形成液体组合物。非还原性二糖成分的浓度 在0.50至3.0％(w/v)的范围内，填充剂的浓度在1.5％至7.5％的范围内， 非离子型表面活性剂的浓度在0.005％至0.5％(w/v)的范围内；并且组合 物的pH在4.5至6.5的范围内。任选地，所述方法还包括干燥液体组合 物以产生稳定的粉末组合物。此外，选择非还原性二糖或非还原性三糖 的量(相对于填充剂的量)以便当干燥液体组合物时，填充剂不结晶。

本发明还提供了包含肉毒杆菌毒素、非还原性糖、非离子型表面活 性剂、生理上相容的缓冲剂、带正电荷的肽和任选的填充剂的液体组合 物。带正电荷的肽具有选自下列的氨基酸序列： RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RGRDDRRQRRR 和YGRKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-YGRKKRRQRRR。液体组合物的pH在4.5至6.5 的范围内。本发明还明确地涉及通过干燥此类液体组合物而制备的粉末 制剂。

本发明的另一个方面提供了用于稳定肉毒杆菌毒素制剂的方法，包 括组合肉毒杆菌毒素、非还原性糖、非离子型表面活性剂、生理上相容 的缓冲剂、带正电荷的肽和任选的填充剂。带正电荷的肽和任选的填充 剂的液体组合物。带正电荷的肽具有选自下列的氨基酸序列： RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR、RGRDDRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RGRDDRRQRRR 和YGRKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-YGRKKRRQRRR。液体组合物的pH在4.5至6.5 的范围内。任选地，所述方法还包括干燥所述液体组合物以产生稳定的 粉末组合物。

附图概述

图1：在40℃下贮存冻干的肉毒杆菌毒素后，作为时间的函数的恢 复的肉毒杆菌毒素活性。

图2：在不同的温度下贮存冻干的肉毒杆菌毒素后，作为时间的函数 的恢复的肉毒杆菌毒素活性。

图3：在不同的温度下贮存冻干的肉毒杆菌毒素后，作为时间的函数 的恢复的肉毒杆菌毒素活性。

发明详述

本发明涉及经稳定的、未添加源自(即，纯化自)动物来源的蛋白质 性质的赋形剂例如白蛋白的肉毒杆菌毒素制剂。因此，本发明的肉毒杆 菌毒素制剂不遭受与血液传播的病原体或其他类型的感染剂相关的潜在 问题。本发明还提供了用于制备未添加动物来源的蛋白质性质的赋形剂 的肉毒杆菌毒素制剂的方法。在优选实施方案中，制剂根本不包含任何 蛋白质性质的赋形剂。然而，在某些实施方案中，非来源于动物来源的 蛋白质性质的赋形剂(例如，重组白蛋白或重组明胶)可存在于本发明的 制剂中。

如本文中与本发明的肉毒杆菌毒素制剂结合使用的，术语“稳定” 和其变型(例如，“稳定作用”、“稳定的”、“经稳定的”等)是指在 指定的时间段内制剂中肉毒杆菌毒素的生物学活性的保持，如通过20只 小鼠的LD50测定而测量的(参见LB Pearce，RE Borodic，Tox.Appl.Pharmacol，v128，p69，1994和ICCVAM/NICEATM/ECVAM，Scientific  Workshop on Alternate Methods to Refine，Reduce and Replace the  Mouse LD50 Assay for Botulinum Toxin Testing，2006年11月14日)。 在优选实施方案中，在指定的时间段内肉毒杆菌毒素的生物学活性得到 100％保持。然而，在其他实施方案中，在指定的时间段内肉毒杆菌毒素 的生物学活性的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％ 得到保持。在某些实施方案中，指定的时间段的持续时间可经选择以与 肉毒杆菌毒素产物的制造过程的持续时间一致。例如，指定的时间段的 持续时间可经选择以足以在将肉毒杆菌毒素经历一个或多个处理步骤时 稳定肉毒杆菌毒素。在其他实施方案中，所述指定的时间段可以是大约 数周、数月或甚至数年，例如当选择非毒素制剂成分以允许长期稳定肉 毒杆菌毒素制剂以便贮存时的情况。在某些实施方案中，所述指定的时 间段是至少2周，至少1个月，至少3个月，至少6个月，至少9个月， 至少1年，至少18个月或至少2年。在其他实施方案中，通过使用本发 明的制剂，所述指定的时间段与肉毒杆菌毒素保持期望量的生物学活性 的时间相一致，所述时间包括例如，如上所述的活性的持续时间。可选 择用于稳定制剂的成分，以允许在低温(例如，-5至-10℃)下或在环境 温度下稳定，如本文中所描述的。

在某些实施方案中，以固体形式提供本发明的肉毒杆菌毒素制剂。 例如，可冻干或真空干燥制剂以产生固体制剂。当以固体形式提供本发 明的肉毒杆菌毒素制剂，并且在其间测量肉毒杆菌毒素制剂的稳定性的 指定的时间段为1周或更短时间时，重建时观察到的活性据认为为初始 恢复时的活性。在本发明的某些优选实施方案中，在初始恢复时活性得 到至少70％、80％或90％的保持。在其他实施方案中，在初始恢复时活性 得到至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的保持。 在特别优选的实施方案中，初始恢复时的活性高于99％并且可以甚至为 100％。

在其他实施方案中，在给定的贮存温度下，在其间测量稳定性的指 定的时间段超过12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或 24个月。当以固体形式提供本发明的肉毒杆菌毒素制剂，并且在其间测 量肉毒杆菌毒素制剂的稳定性的指定的时间段为12个月或更长时，重建 时观察到的活性据认为为长期贮存时的活性。在某些优选实施方案中， 当长期贮存时肉毒杆菌毒素的活性得到至少70％、80％或90％的保持。在 某些实施方案中，当长期贮存时肉毒杆菌毒素的活性得到90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的保持。在某些实施方案中，在 25℃下贮存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24 个月后，肉毒杆菌毒素的活性得到至少90％的保持；在25℃下贮存12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月后，肉毒杆 菌毒素的活性得至少91％的保持；在25℃下贮存12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23或24个月后，肉毒杆菌毒素的活性得至 少92％的保持；在25℃下贮存12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23或24个月后，肉毒杆菌毒素的活性得至少93％的保持；在 25℃下贮存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24 个月后，肉毒杆菌毒素的活性得至少94％的保持；在25℃下贮存12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月后，肉毒杆菌毒 素的活性得至少95％的保持；在25℃下贮存12、13、14、15、16、17、 18、19、20、21、22、23或24个月后，肉毒杆菌毒素的活性得至少96％ 的保持；在25℃下贮存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23或24个月后，肉毒杆菌毒素的活性得至少97％的保持；在25℃下贮 存12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月后， 肉毒杆菌毒素的活性得至少98％的保持；或在25℃下贮存12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23或24个月后，肉毒杆菌毒素的 活性得至少99％的保持。

在本发明的某些实施方案中，以液体形式而非固体形式贮存肉毒杆 菌毒素制剂。在某些优选实施方案中，根据本发明的液体肉毒杆菌毒素 制剂在室温下保持至少60％、70％、80％或90％的肉毒杆菌毒素活性达到8 小时。在特别优选实施方案中，根据本发明的液体肉毒杆菌毒素制剂在 室温下保持100％的肉毒杆菌毒素活性达到8小时。

本发明的肉毒杆菌毒素制剂中的赋形剂有利地减少或消除在制造和 贮存过程中籍以使肉毒杆菌毒素损失的机制。不希望受理论束缚，据认 为，本发明的非蛋白质性质的赋形剂减少或消除不想要的肉毒杆菌毒素 至用于制造、贮存或递送制剂的容器的粘附。此类容器的非限定性实例 包括利用玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯和其他聚合物制造的容器。此外，并 且再次地不希望受理论限制，据认为，本发明的非蛋白质性质的赋形剂 可减少或防止肉毒杆菌毒素与肉毒杆菌毒素在制造、贮存或递送过程中 所遇到的物体或物质之间的不想要的反应。在优选实施方案中，非蛋白 质性质的赋形剂对于制剂的其他成分是惰性的。

在某些实施方案中，以粉末形式制备肉毒杆菌毒素制剂以易于操作、 运输或贮存。可通过本领域已知的任何方法制备粉剂形式。此类方法的 非限定性实例包括冷冻干燥、真空干燥、转鼓式干燥(drum-drying)和喷 雾干燥，其中冷冻干燥和真空干燥是特别优选的。

本文中所使用的术语“肉毒杆菌毒素”意欲指任何已知类型的肉毒 杆菌毒素，无论是由细菌产生的还是通过重组技术产生的，以及可随后 发现的任何这样的类型，包括工程变体或融合蛋白。如上文中所提及的， 目前，已表征了7种免疫学独特的肉毒杆菌神经毒素，即肉毒杆菌神经 毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，其每一种通过利用类型特异性抗体 的中和作用来区别。肉毒杆菌毒素血清型可从Sigma-Aldrich和从 Metabiologics，Inc.(Madison，Wis.)以及从其他来源获得。肉毒杆菌 毒素的不同血清型在它们影响的动物物种方面和在它们引发的麻痹的严 重性和持续时间方面可发生变化。

用于本发明的组合物的肉毒杆菌毒素可选地可以是肉毒杆菌毒素衍 生物，即，具有肉毒杆菌毒素活性但相对于天然存在或重组的天然肉毒 杆菌毒素而言在任何部分上或任何链上包含一种或多种化学或功能改变 的化合物。例如，肉毒杆菌毒素可以是经修饰的神经毒素(例如，与天然 或重组产生的神经毒素或其衍生物或片段相比较，至少一个其氨基酸被 缺失、修饰或替代的神经毒素)。例如，肉毒杆菌毒素可以是已以例如增 强其性质或减小其不期望的副作用但仍然保留期望的肉毒杆菌毒素活性 的方式修饰的肉毒杆菌毒素。肉毒杆菌毒素可以是由细菌产生的任何肉 毒杆菌毒素复合物，如上所述的。可选择地，肉毒杆菌毒素可以是使用 重组或合成化学技术制备的毒素(例如，重组肽、融合蛋白或杂种神经毒 素，如从不同肉毒杆菌毒素血清型的亚基或结构域制备的那些(例如，参 见美国专利No.6,444,209))。肉毒杆菌毒素也可以是已显示具有所需 的肉毒杆菌毒素活性的总体分子的一部分，并且在这样的情况下本身可 被使用或作为组合或缀合分子例如融合蛋白的一部分使用。此外，肉毒 杆菌毒素可以以肉毒杆菌毒素前体的形式存在，所述前体本身可以是非 毒性的，例如在蛋白水解切割后变得有毒性的无毒性锌蛋白酶。

本文中所使用的术语″肉毒杆菌毒素复合物″或″毒素复合物″是指与 相关内源非毒素蛋白质(即，由肉毒梭菌产生的血凝素蛋白和非毒素非血 凝素蛋白)在一起的约150kD的肉毒杆菌毒素蛋白分子(属于肉毒杆菌毒 素血清型A-G的任一种)。然而，应指出，肉毒杆菌毒素复合物作为一个 单一毒素复合物不必一定来源于肉毒梭菌。例如，可以首先重组制备肉 毒杆菌毒素或经修饰的肉毒杆菌毒素，随后将其与非毒素蛋白组合。还 可购买重组肉毒杆菌毒素(例如，从List Biological Laboratories， Campbell，CA购买)，随后将其与非毒素蛋白组合。

本发明还涉及″减少的肉毒杆菌毒素复合物″，其中所述肉毒杆菌毒 素复合物具有与在由肉毒梭菌产生的肉毒杆菌毒素复合物中天然发现的 量相比较减少量的非毒素蛋白。在一个实施方案中，使用任何常规的蛋 白质分离法，从来源于肉毒梭菌的肉毒杆菌毒素复合物提取一部分血凝 素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，以制备减少的肉毒杆菌毒素复合物。例 如，可通过经由在pH 7.3下暴露于红细胞而解离肉毒杆菌毒素复合物来 产生减少的肉毒杆菌毒素复合物(参见，例如，EP 1514556A1，通过引 用引入本文)。可使用HPLC、透析、柱子、离心和其他用于从蛋白质提 取蛋白质的方法。可选择地，当通过将合成产生的肉毒杆菌毒素与非毒 素蛋白组合来产生减少的肉毒杆菌毒素复合物时，可简单地向混合物中 加入，与天然存在的肉毒杆菌毒素复合物中存在的量相比，更少的血凝 素或非毒素非血凝素蛋白。在根据本发明的减少的肉毒杆菌毒素复合物 中，任何非毒素蛋白(例如，血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或两者) 可独立地减少任何量。在某些示例性实施方案中，一种或多种非毒素蛋 白，与肉毒杆菌毒素复合物中通常发现的量相比较，减少至少约0.5％、 1％、3％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一 个实施方案中，从肉毒杆菌毒素复合物中除去基本上全部的在来源于肉 毒梭菌的肉毒杆菌毒素复合物中通常发现的非毒素蛋白(例如，超过95％ 的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。在另一个实施方案中，只使用无 任何血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白的纯肉毒杆菌毒素分子。此外， 虽然在某些情况下，内源非毒素蛋白的量可减少相同的量，但本发明还 涉及使每一种内源非毒素蛋白减少不同的量，以及减少至少一种内源非 毒素蛋白，但不减少其他蛋白质。

本发明还涉及肉毒杆菌毒素的组合和混合物的一般用途，尽管由于 它们的不同性质和特性，在卫生保健或美容工业中目前通常不施用肉毒 杆菌毒素血清型的混合物。

本发明的肉毒杆菌毒素制剂包含非离子型表面活性剂。通常，本发 明涉及具有稳定肉毒杆菌毒素的能力且适合于药物用途的任何非离子型 表面活性剂的使用。在某些实施方案中，非离子型表面活性剂是聚山梨 醇酯，其非限定性实例包括聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯 60和聚山梨醇酯80。在其他实施方案中，非离子型表面活性剂是山梨聚 糖酯，其非限定性实例包括Span 20、Span 60、Span 65和Span 80。 本发明还涉及泊洛沙姆的使用，其非限定性实例包括泊洛沙姆181、泊 洛沙姆188和泊洛沙姆407。本发明还涉及将Triton X-100或NP-40用 作非离子型表面活性剂。此外，本发明涉及其中联合使用不同非离子型 表面活性剂的组合的实施方案。在某些优选实施方案中，非离子型表面 活性剂选自聚山梨醇酯、泊洛沙姆和山梨聚糖，其中聚山梨醇酯和山梨 聚糖是特别优选的。在优选实施方案中，非离子型表面活性剂的浓度在 0.005％至0.5％的范围内，或在0.01％至0.2％的范围内，或在0.02％至0.1％ 的范围内或在0.05至0.08％的范围内。本发明还涉及其中非离子型表面 活性剂的浓度为0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、 0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％的制剂。

本发明的肉毒杆菌毒素包含非还原性糖。在优选实施方案中，非还 原性糖具有高于55℃、57℃或60℃的玻璃转化温度。不希望受理论束缚， 据认为，此类玻璃转化温度高至足以抑制引起肉毒杆菌毒素变性的不期 望的分子运动。在某些特别优选的实施方案中，非还原性糖是二糖，其 非限定性实例包括海藻糖和蔗糖。在其他实施方案中，非还原性糖是三 糖，其非限定性实例是棉子糖。通常，本发明的肉毒杆菌毒素制剂中非 还原性糖的浓度在10％至40％(w/v)，优选10％至25％(w/v)，更优选15％ 至20％(w/v)的范围内。在某些优选实施方案中，非还原性糖的浓度为 10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％(w/v)。 当非还原性糖是海藻糖时，优选地海藻糖的水合形式(即，海藻糖-二水 合物)用于制备制剂，虽然同样还涉及海藻糖的无水形式的使用。

此外，本发明的一个方面是认识到：非还原性糖的选择可用于将肉 毒杆菌毒素制剂的稳定性确定为温度的函数。例如，当肉毒杆菌毒素制 剂经历无冷冻的条件时，有利地使用海藻糖作为非还原性糖，因为海藻 糖在环境温度下赋予肉毒杆菌毒素稳定性。因此，可在不同制造过程中 在环境温度下有利地加工本发明的含海藻糖制剂而无肉毒杆菌毒素活性 的可察觉的损失。在其中将冷却肉毒杆菌毒素制剂的情况下(例如，在持 续数月或甚至数年的长期贮存过程中)，可选择蔗糖作为非还原性糖。本 发明还涉及糖的混合物。例如，在某些实施方案中，将蔗糖和海藻糖二 者加入肉毒杆菌毒素制剂。糖混合物的成分的比率将取决于要实现的效 果并且可通过常规实验来确定。也在本发明的范围内的是，在纯化、制 造或贮存的不同阶段过程中单独或组合地使用不同的非还原性糖，例如 二糖。因此，例如，可在较高的温度(例如，环境温度)下在初始加工和/ 或纯化的过程中使用海藻糖，随后除去海藻糖并且用蔗糖替代海藻糖。 可以通过例如透析、层析或本领域内已知的其他方法实现一种非还原性 糖例如二糖的去除和对另一种糖的替代。

本发明的另一个方面是认识到：本文中指定的非还原性糖(或糖类) 对于某些实施方案可用作固体肉毒杆菌毒素制剂的主要填充剂。具体地， 已发现，非还原性糖，当以本文中指定的量加入时，可在冻干或真空干 燥肉毒杆菌毒素制剂后形成稳定且力学上坚固的饼状物。不希望受理论 限制，据认为此类制剂中的非还原性糖形成无定型固体，其中非还原性 糖上的羟基随机确定非还原性糖的方向以使氢键键合最大化，这稳定了 肉毒杆菌毒素并且赋予固体饼状物力学坚固性。在某些优选实施方案中， 本文中描述的非还原性糖用作肉毒杆菌毒素制剂的唯一填充剂。在其他 优选实施方案中，非还原性糖用作主要填充剂，但向肉毒杆菌毒素制剂 加入少量第二填充剂。第二填充剂不受特别限制，并且可以是对肉毒杆 菌毒素制剂的稳定性不具有不可接受的不利作用的任何填充剂。当使用 具有结晶倾向的第二填充剂时，优选以足够低的浓度加入它们，以便它 们不能结晶。不希望受理论限制，据认为此类第二填充剂的结晶对在冻 干或真空干燥后获得的固体饼状物的稳定性具有不利影响。

本发明的其他方面是出人意料的结果：非还原性糖，在本文中描述 的浓度上，不仅可用于稳定冻干的肉毒杆菌毒素制剂，而且还可用于稳 定溶液相中的肉毒杆菌毒素制剂。

在优选实施方案中，肉毒杆菌毒素制剂包含缓冲剂。通常，能够使 pH维持在4.5至6.5的范围内，更优选在5至6的范围内以及最优选在 约5.5的任何生理上相容的缓冲剂适合用于本发明的肉毒杆菌毒素制 剂。此类缓冲剂的非限定性实例包括包含柠檬酸、醋酸、琥珀酸、酒石 酸、马来酸和组氨酸的盐的缓冲剂。适当的缓冲剂浓度的非限定性实例 包括在0.400％至0.600％；0.450％至0.575％或0.500％至0.565％的范围内 的缓冲剂浓度。本发明还涉及包含缓冲盐的混合物的肉毒杆菌毒素制剂， 所述混合物的非限定性实例包括柠檬酸盐/醋酸盐、柠檬酸盐/组氨酸、 柠檬酸盐/酒石酸盐、马来酸盐/组氨酸或琥珀酸盐/组氨酸。在某些优选 实施方案中，缓冲剂是磷酸盐缓冲剂。

在某些实施方案中，肉毒杆菌毒素制剂包含使得更易于操作肉毒杆 菌毒素制剂的冻干形式的填充剂(除了非还原性糖外)。在某些优选实施 方案中，填充剂在冷冻干燥条件下结晶并且当以固体状态存在时不与其 他赋形剂充分混合。然而，在其他优选实施方案中，填充剂在冷冻干燥 条件下保持无定形，即使已知其在冷冻过程中具有结晶的倾向(例如，甘 露醇或甘氨酸)。如本领域技术人员所理解的，填充剂在冷冻干燥过程中 是结晶还是保持无定形受若干因素控制，包括填充剂的类型、填充剂相 对于制剂的其他成分的量以及冷冻干燥制剂的速率。在某些优选实施方 案中，调整非还原性糖相对于填充剂的量以抑制填充剂的结晶。在该情 况下，基于重量百分比，非还原性糖对填充剂的比率可以大于0.33∶1； 0.5∶1，0.75∶1；1∶1；2∶1，3∶1或4∶1。本发明涉及的填充剂的非限制 性实例包括山梨醇、甘露醇、甘氨酸、精氨酸和组氨酸。在某些实施方 案中，填充剂的浓度可在1％至10％，2％至6％，3％至5％或4％至4.5％(w/v) 的范围内。在某些优选实施方案中，当使用填充剂时，非还原性糖的浓 度可从10％至40％(w/v)的范围减少至0.5％至3.0％(w/v)的范围。此外， 在某些优选实施方案中，非还原性糖对填充剂的比率在0.07至2.0的范 围内，优选在0.4至0.6的范围内。因此，例如，制剂可包含甘露醇作 为填充剂以及海藻糖二水合物作为非还原性糖，其中甘露醇以1.5％至 7.5％(w/v)的浓度范围存在并且海藻糖以0.5％至3.0％(w/v)的浓度范围 存在。优选，填充剂不是氯化钠。

可通过任何常规施用途径施用本发明的肉毒杆菌毒素制剂。在本发 明的某些实施方案中，通过肌内或皮下注射将肉毒杆菌毒素制剂施用至 受试者中。在其他实施方案中，局部施用肉毒杆菌毒素制剂。无论局部 施用还是通过注射施用肉毒杆菌毒素制剂，所述制剂可包含具有带正电 荷的效应基团(efficiency group)的带正电荷的载体(如上文中所描述 的)以促进肉毒杆菌毒素至目标组织内的渗透。然而，应当指出，带正电 荷的载体不是稳定所必需的，并且本发明涉及其中制剂不包含这样的带 正电荷的载体的实施方案。本发明的肉毒杆菌毒素制剂也可通过药物递 送装置来施用，其非限定性实例是皮肤贴剂。

当局部施用肉毒杆菌毒素制剂时，有利地在制剂中包含具有带正电 荷的分支基团的带正电荷的载体(如上文中所描述的)，以促进肉毒杆菌 毒素的经皮渗透(也参见美国专利申请09/910,432；11/073,307； 11/072,026和10/793,138，将每一个所述专利申请通过引用整体并入本 文)。在不使用带正电荷的载体或某些增强经皮运输的其他手段的情况 下，预期局部施用的肉毒杆菌毒素的经皮通量相当低。应当指出，除了 本文中描述的带正电荷的载体的使用外，对于本发明的肉毒杆菌毒素制 剂，本发明还涉及增强经皮运输的其他方法的使用。此类方法的非限定 性实例包括使用脂质体、电离子透入疗法(iontophoresis)、胶束等进行 的肉毒杆菌毒素制剂的经皮递送。

此外，当局部施用肉毒杆菌毒素制剂时，通常有利地将它们与胶凝 剂和/或粘度调节剂(viscosity-modifying agent)混合以增加制剂的粘 度，从而使肉毒杆菌毒素的施用更容易和更精确。此外，如果使用带正 电荷的载体，那么这些试剂可帮助防止含水肉毒杆菌毒素/载体制剂干掉 (这倾向于引起肉毒杆菌毒素的活性降低)。特别优选的试剂是不带电荷 的并且不干扰肉毒杆菌毒素活性或毒素-载体复合物穿过皮肤的效率的 那些试剂。例如，胶凝剂可以是某些基于纤维素的胶凝剂，例如羟丙纤 维素(HPC)。在某些实施方案中，将肉毒杆菌毒素/载体复合物配制于具 有2-4％HPC的组合物中。可选择地，可通过加入聚乙二醇(PEG)改变含 有肉毒杆菌毒素/载体复合物的溶液的粘度。在其他实施方案中，将肉毒 杆菌毒素/载体溶液与预混合的粘性试剂例如Cetaphil湿润剂组合。在 其他实施方案中，粘度调节剂是泊洛沙姆，其非限定性实例包括泊洛沙 姆188和泊洛沙姆407。粘度调节剂还可以是聚丙烯酸、聚酰胺或植物 胶(例如，瓜尔胶)。此外，可将本文中描述的肉毒杆菌毒素制剂与赋形 剂混合，以形成乳剂(包括微乳剂)、悬浮剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、粉 剂或用于给皮肤或其中可使用所述组合物的其他组织施用的其他常见的 固体或液体组合物。此类组合物还可包含通常用于此类产品的其他成分， 例如抗微生物剂、湿润剂和水化剂(hydration agent)、渗透剂、防腐剂、 乳化剂、天然或合成油、溶剂、表面活性剂、去垢剂、润滑剂、抗氧化 剂、芳香剂、充填剂(filler)、增稠剂、蜡、气味吸收剂、染料、着色 剂、粉剂，和任选地麻醉剂、抗痒添加剂(anti-itch additive)、植物 提取物、调理剂(conditioning agent)、增深剂(darkening agent)或增 白剂(lightening agent)、闪烁剂(glitter)、保湿剂(humectant)、云 母(mica)、矿物质、多酚、硅酮或其衍生物、防晒剂、维生素和植物药 物(phytomedicinal)。

本发明还提供了用于制备和/或施用本发明的肉毒杆菌毒素制剂的 试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包括肉毒杆菌毒素以及产生根据本 发明的稳定的制剂所需的此类另外的赋形剂。试剂盒还可包括可用于产 生这样的制剂的预混合物。在其他实施方案中，试剂盒包括已被冻干的 根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂和用于递送所述制剂的装置，其非限定 性实例是注射器。

本发明提供了在治疗过程中将“治疗量”的肉毒杆菌毒素递送至受 试者的制剂。如本文中所使用的，术语“治疗量”是指足以产生期望的 效果(例如，肌肉的松弛，皱纹的治疗，疼痛的治疗或活动过度的腺例如 汗腺的活动的减少)的肉毒杆菌毒素的量。肉毒杆菌毒素的“治疗量”隐 含地理解为不引起不想要的麻痹或其他不期望的或有害的副作用的安全 量。施用的肉毒杆菌毒素的具体量将取决于几个因素，包括施用途径、 施用位置、待治疗的适应症和特定制剂中的肉毒杆菌毒素的血清型。例 如，当选择A型血清型肉毒杆菌毒素时，治疗量可在10U至150U或 1,000U至2,500U的范围内。在其他优选实施方案中，治疗量的范围 为400U至800U和1,000U至50,000U，优选2,000至35,000U，更 优选3,000U至30,000U，以及更优选4,000U至25,000U。在某些实 施方案中，治疗量的范围为4,000U至8,000U，9,000U至19,000U 或20,000U至40,000U。

施用本发明的组合物以引起期望的效果，所述效果可以是美容或治 疗效果。期望的效果包括某些肌肉的松弛(目的在于例如，减少细纹和/ 或皱纹的出现(特别是在脸上)或以其他方式调整面容例如拓宽眼睛、提 升嘴角或抹平从上唇散开的纹)，或肌张力的总体缓解。可在脸或其他地 方实现最后提及的效果，肌张力的总体缓解。本发明的组合物可包含适 当有效量的肉毒杆菌毒素以用作单剂量治疗，或可被更加浓缩以用于在 施用的位置稀释或用于多次施用。可给受试者施用稳定的肉毒杆菌毒素 复合物或稳定的减少的肉毒杆菌毒素复合物，以治疗状况例如不期望的 面肌或其他肌痉挛、多汗症、痤疮或其中期望缓解肌肉疼痛或痉挛的身 体其他地方的状况。将肉毒杆菌毒素施用递送至肌肉或至其他皮肤相关 结构。可对例如脸、腿、肩、背(包括腰)、腋、掌、足、颈、腹股沟、 手或足的背部、肘、上臂、膝、大腿、臀部、躯干、骨盆或期望施用肉 毒杆菌毒素的身体的任何其他部分进行施用。

在某些优选实施方案中，本发明的肉毒杆菌毒素制剂包含具有带正 电荷的效应基团的带正电荷的载体。在该情况下，带正电荷的载体以足 以促进肉毒杆菌毒素至目标组织的渗透的量存在。如本文中所使用的， 术语“带正电荷的”意指载体在至少某些溶液相条件下，更优选在至少 某些生理上相容的条件下具有正电荷。更具体地，“带正电荷的”意指 所述基团包含在所有pH条件下带电荷的官能性(例如季胺)，或包含可在 某些溶液相条件下获得正电荷(例如在伯胺的情况下，pH的改变)的官能 性。更优选，本文中所使用的“带正电荷的”是指，在生理上相容的条 件下具有与阴离子缔合的行为的那些基团。具有多个带正电荷的部分的 聚合物不必一定是同聚物，这对于本领域技术人员来说是显然的。带正 电荷的部分的其他实例在现有技术中是公知的并且可容易地使用，这对 于本领域技术人员来说是显然的。

通常，带正电荷的载体包含带正电荷的主链，其通常是原子链，并 且在生理pH下在链中具有携带正电荷的基团，或携带正电荷的基团连接 至从主链延伸的侧链。优选，带正电荷的主链本身不具有确定的酶促或 治疗生物学活性。线性主链是烃主链，其在某些实施方案中被选自氮、 氧、硫、硅和磷的杂原子间隔。大部分主链链原子通常是碳。此外，主 链通常是重复单位的聚合物(例如，氨基酸、聚(氧乙烯)、聚(丙烯胺)、 聚亚烷基亚胺(polyalkyleneimine)等)，但也可以是异聚物。在一组实 施方案中，带正电荷的主链是聚丙烯胺(polypropyleneamine)，其中许 多胺的氮原子作为携带正电荷的铵基(四取代的)存在。在另一个实施方 案中，带正电荷的主链是非肽基聚合物，其可以是异聚物或同聚物例如 聚亚烷基亚胺，例如聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺，其具有约100至约 2,500,000D，优选约250至约1,800,000D，最优选约1000至约 1,400,000D的分子量。在另一组实施方案中，主链已连接多个侧链部 分，所述侧链部分包含带正电荷的基团(例如，铵基、吡啶鎓基、鏻基 (phosphonium group)、锍基、胍鎓基或脒鎓基)。该组实施方案中的侧 链部分可沿主链间隔放置，其间隔是一致的或可变的。此外，侧链的长 度可以相似或不相似。例如，在一组实施方案中，侧链可以是具有1至 20个碳原子并且在远端(远离主链)以上述带正电荷的基团之一终止的线 性或分支烃链。在本发明的所有方面，载体与肉毒杆菌毒素之间的结合 是通过非共价相互作用进行的，其非限定性实例包括离子相互作用、氢 键键合、范德瓦尔斯力或其组合。

在一组实施方案中，带正电荷的主链是具有多个带正电荷的侧链基 团(例如，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、高精氨酸等)的多肽。优选，所述 多肽具有约100至约1,500,000D，更优选约250至约1,200,000D，最 优选约1000至约1,000,000D的分子量。本领域技术人员将理解，当将 氨基酸用于本发明的该部分时，侧链可在连接的中心具有D-或L-型(R 或S构型)。在某些优选实施方案中，多肽具有约500至约5000D，更 优选1000至约4000D，更优选约2000至约3000D的分子量。在其他 实施方案中，多肽具有至少约10,000的分子量。

在另一个实施方案中，主链部分是聚赖氨酸并且效应基团，如本文 中所描述的，连接至所述聚赖氨酸。聚赖氨酸可具有约100至约 1,500,000D，优选约250至约1,200,000D，最优选约1000至约3000D 的分子量。在一个示例性实施方案中，具有带正电荷的效应基团的带正 电荷的载体是具有氨基酸序列RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR、 RGRDDRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RGRDDRRQRRR或YGRKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G- YGRKKRRQRRR的肽。其也可以是任何商购可得(Sigma Chemical Company， St.Louis，Mo.，USA)的聚赖氨酸，例如具有MW＞70,000D的聚赖氨酸， 具有70,000至150,000D的MW的聚赖氨酸，具有MW 150,000至300,000 D的聚赖氨酸和具有MW＞300,000D的聚赖氨酸。适当的聚赖氨酸的选择 将取决于组合物的其余成分并且足以给组合物提供总体净正电荷，并且 提供优选为带负电荷的成分的组合长度的1至4倍的长度。

可选择地，主链可以是多肽的类似物例如类肽。参见，例如，Kessler， Angew.Chem.Int.Ed.Engl.32：543(1993)；Zuckermann等人 Chemtracts--Macromol.Chem.4：80(1992)；和Simon等人Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 89：9367(1992))。简而言之，类肽是其中侧链连接至 主链氮原子而非α-碳原子的多聚甘氨酸。如上所述，一部分侧链通常以 带正电荷的基团终止，以提供带正电荷的主链成分。类肽的合成描述于 例如美国专利5,877,278中，其通过引用整体并入本文。当在本文中使 用该术语时，具有类肽主链结构的带正电荷的主链被认为是“非肽”， 因为它们不由在α-碳位置上具有天然存在的侧链的氨基酸组成。

可使用许多种其他主链，其采用例如多肽的空间或电子模拟物，其 中肽的酰胺键被替代物替代，例如酯键、硫代酰胺(--CSNH--)、反向硫 代酰胺(--NHCS--)、氨基亚甲基(--NHCH₂--)或反向亚甲基氨基 (--CH₂NH--)基团、酮亚甲基(--COCH₂--)基团、亚膦酸酯(--PO₂RCH₂--)、 氨基磷酸盐和氨基磷酸酯(--PO₂RNH--)、反向肽(--NHCO--)、反式烯烃 (--CR＝CH--)、氟代烯烃(--CF＝CH--)、二亚甲基(--CH₂CH₂--)、硫醚 (--CH₂S--)、羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)、亚甲基氧(--CH₂O--)、四唑 (CN₄)、磺酰氨基(--SO₂NH--)、亚甲基磺酰氨基(--CHRSO₂NH--)、反向亚 酰氨基(--NHSO₂--)，以及具有丙二酸盐(酯)和/或偕-二氨基-烷基亚单 位的主链，例如，如由Fletcher等人((1998)Chem.Rev.98：763)综述 的和由其中引用的参考文献详细描述的。许多上述置换导致，相对于由 α-氨基酸形成的主链，大致电子等排的聚合物主链。

在上文提供的每一个主链中，可附加携带带正电荷的基团的侧链基 团。例如，磺酰胺基连接的主链(--SO₂NH--和--NHSO₂--)可具有连接至氮 原子的侧链基团。类似地，羟基亚乙基(--CH(OH)CH₂--)连接可携带连接 至羟基取代基的侧链基团。通过使用标准合成方法，本领域技术人员可 容易地采用其他连接化学来提供带正电荷的侧链基团。

在本发明的某些实施方案中，带正电荷的载体包含带正电荷的效应 基团。效应基团的非限定性实例包括-(gly)_n1-(arg)_n2(其中下标n1是0 至20，更优选0至8，更优选2至5的整数，并且下标n2独立地是约5 至约25，更优选约7至约17，最优选约7至约13的奇整数)、HIV-TAT 或其片段、或Antennapedia PTD或其片段。优选，侧链或分支基团具有 上述通式-(gly)_n1-(arg)_n2。其他优选实施方案是，其中分支或效应基团 是具有式(gly)_p-RGRDDRRQRRR-(gly)_q、(gly)_p-YGRKKRRQRRR-(gly)_q或 (gly)_p-RKKRRQRRR-(gly)_q的HIV-TAT片段的那些基团，其中下标p和q 各自独立地是0至20的整数并且所述片段通过片段的C末端或N末端连 接至载体分子。侧链分支基团在连接的中心可具有D-或L-型(R或S构 型)。优选的HIV-TAT片段是这样的片段，其中下标p和q各自独立地是 0至8，更优选2至5的整数。其他优选实施方案是，其中分支基团为 Antennapedia PTD基团或其片段(所述片段保留所述基团的活性)的那些 实施方案。这些在本领域内是已知的，例如参见，Console等人，J.Biol.Chem.278：35109(2003)。优选，带正电荷的载体按总载体重量的百分 比计，以至少约0.05％，优选约0.05至约45重量％，最优选约0.1至约 30重量％的量包含侧链，带正电荷的分支基团。对于具有式 -(gly)_n1-(arg)_n2的带正电荷的分支基团，最优选的量为约0.1至约25％。

下列实施例意欲提供本发明的不同实施方案的非限定性举例说明。 如本领域技术人员将理解的，可进行改变而不背离本发明的精神和范围。

实施例

实施例1：肉毒杆菌毒素制剂的制备

通过将适当量的海藻糖二水合物、聚山梨醇酯-20、组氨酸和盐酸组 氨酸组合以产生2x制剂储备液来制备本发明的示例性肉毒杆菌毒素制 剂，所述制剂储备液包含36％海藻糖二水合物、0.05％聚山梨醇酯-20和 1.126％组氨酸(pH 5.5)。将溶液冷却至4℃。通过离心从硫酸铵储备悬 浮液沉淀肉毒杆菌毒素API。将毒素沉淀溶解在具有0.05％聚山梨醇酯 -20的0.56％组氨酸缓冲剂(pH 5.5)中。用组氨酸/聚山梨醇酯-20溶液 进一步稀释该溶液以产生1.074μg/mL溶液的毒素储备液。

通过将充足的肽溶解至水中以产生6.0mg/mL肽的溶液来制备载体 肽RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR的储备液。将毒素储备液、肽储备液、 0.56％组氨酸缓冲剂和2x制剂储备液组合以产生由18％海藻糖二水合物、 0.025％聚山梨醇酯-20、0.56％组氨酸缓冲剂、55ng/mL毒素和150μg/mL 载体肽组成的制剂原料药产品。

实施例2：肉毒杆菌毒素制剂的冷冻干燥

本实施例提供了用于根据本发明的肉毒杆菌毒素制剂的冷冻干燥方 法。将实施例1中描述的制剂原料药产品的200μL等分转移至55个2-mL 玻璃瓶的每一个中。将灰色丁基橡胶冷冻干燥塞宽松地置于玻璃瓶的上 方。将小瓶置于冷冻干燥器中并且起始冷冻干燥。

冷冻干燥法包括3个主要阶段：(1)冷冻阶段；(2)第一干燥阶段； 和(3)第二干燥阶段。这3个主要阶段的每一个阶段包括一个或多个单独 的处理步骤，其在下面指定的温度和压力下进行。完成第一干燥所需的 第一干燥时间视瓶子的数目和瓶子中的填充体积而变化。

冷冻

冷冻，冷凝器和抽真空：

冷冻温度：-40℃Shelf或Product Ave

额外冷冻时间：0分钟

真空起始允许：-45 Avg Cond℃

热起始允许：200mTorr

第一干燥

第二干燥

步骤

1        H        27        160        100

实施例3：具有海藻糖二水合物的肉毒杆菌毒素制剂的稳定性

图1和2显示稳定性研究的结果，在所述研究中，如上所述制备利 用海藻糖二水合物制备的两种不同毒素浓度(11ng/瓶和1.1ng/瓶)的 成瓶的肉毒杆菌毒素制剂，将其于4℃、25℃和40℃下贮存，并且在指 定的时间点上进行测试以测定肉毒杆菌毒素的生物学活性，进行长达18 个月的持续时间。使用LD₅₀小鼠测定法测量活性，并且将活性在图1和2 中报告为肉毒杆菌毒素的当量单位/瓶。在实验开始时(t＝O)，观察到的 活性为1802个单位的肉毒杆菌毒素/瓶(对于图1中的制剂)和192个单 位的肉毒杆菌毒素/瓶(对于图2中的制剂)。图1和2中观察到的肉毒杆 菌毒素活性的变异性据认为由使用LD₅₀小鼠测定法和小样本数量(n＝1瓶 /温度-时间点)获得的数据的固有噪声导致。尽管存在该变异性，但数据 仍然显示，在该18个月的研究中，甚至在40℃的贮存温度下，不存在 损失恢复的活性的倾向。这些数据提供了本发明的示例性肉毒杆菌毒素 制剂的稳定性的实例。

实施例4：具有蔗糖的肉毒杆菌毒素制剂的稳定性

图3显示稳定性研究的结果，在所述研究中，使用上文中对于含海 藻糖的制剂所描述的方案，制备成瓶的具有蔗糖的11ng/瓶的肉毒杆菌 毒素制剂，将其在4℃和25℃下贮存，并且在指定的时间点进行测试以 测定肉毒杆菌毒素的生物学活性，进行达18个月的持续时间。使用如上 所述的LD₅₀小鼠测定法测量活性，并且将活性在图3中报告为肉毒杆菌 毒素的当量单位/瓶。在实验开始时(t＝0)，观察到的活性为2299个单位 的肉毒杆菌毒素/瓶。图3中观察到的肉毒杆菌毒素活性的变异性据认为 由使用LD₅₀小鼠测定法和小样本数量(n＝1瓶/温度-时间点)获得的数据 的固有噪声导致。尽管存在该变异性，但数据仍然显示，在该18个月的 研究中，甚至在25℃的贮存温度下，不存在损失恢复的活性的倾向。这 些数据提供了本发明的示例性肉毒杆菌毒素制剂的稳定性的实例。

实施例5：具有填充剂的肉毒杆菌毒素制剂的冷冻干燥

在本实施例中，通过将适当量的海藻糖二水合物、甘露醇、聚山梨 醇酯-20、组氨酸和盐酸组氨酸组合以产生制剂储备液来制备肉毒杆菌毒 素制剂，所述制剂储备液包含3％海藻糖二水合物、7.5％甘露醇、0.05％ 聚山梨醇酯-20和0.563％组氨酸(pH 5.5)。将溶液冷却至4℃。通过离 心从硫酸铵储备悬浮液沉淀肉毒杆菌毒素API。将毒素沉淀溶解在制剂 储备液中。该溶液的浓度为117μg/mL。用相同的溶液将该溶液进一步 稀释至11.7μg/mL的终毒素储备液浓度。将充足量的具有氨基酸序列 RKKRRQRRR-G-(K)₁₅-G-RKKRRQRRR的载体肽溶解在水中以制备20mg/mL 的载体肽储备液。组合这些溶液以产生具有3％海藻糖二水合物、7.5％甘 露醇、0.05％聚山梨醇酯-20和0.563％组氨酸(pH5.5)、75μg/mL载体 肽和5.5ng/mL毒素的终组成的制剂原料药产品。

将制剂原料药产品的200μL等分加入192个2-mL玻璃冷冻干燥瓶 的每一个瓶中。将灰色丁基橡胶塞宽松地置于小瓶的上方。将小瓶置于 冷冻干燥器中并且起始冷冻干燥。

如先前的实施例一样，冷冻干燥法包括3个主要阶段：(1)冷冻阶段； (2)第一干燥阶段；和(3)第二干燥阶段。这3个主要阶段的每一个阶段 包括一个或多个单独的处理步骤，其在下面指定的温度和压力下进行：

冷冻

冷冻，冷凝器和抽真空：

冷冻温度：-45℃Shelf或Product Ave

额外冷冻时间：1分钟

真空起始允许：-40 Avg Cond℃

热起始允许：300mTorr

第一干燥

第二干燥

步骤

1        H        27        540        100