一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗及其制备方法。本发明利用自行分离的三株不同血清型鸭疫里默氏杆菌菌株，分别接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，然后按照一定比例混合均匀，加入矿物油佐剂乳化，制备出一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，能够有效预防鸭传染性浆膜炎。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，属于兽用生物制品领域。

背景技术

鸭传染性浆膜炎，又称鸭疫里默氏杆菌病、鸭疫巴氏杆菌病、鸭败血症、鸭疫综合征， 是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer，RA）引起的一种鸭的急性、败血性的传染病。 Hendrickson和Hilbert 1932年首次报道纽约长岛的北京鸭发生本病。本病呈急性或慢性败血 症，以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎和脑膜炎为特征，慢性经过的鸭主要表现为脑膜炎 症状（俞永裕，施建明．浅谈鸭传染性浆膜炎的诊治．上海畜牧兽医通讯，2000，(2)：22～ 23）。1～8周龄雏鸭易感，恶劣环境可诱发本病，本病死亡率最高可达75％（胡建华，孙凤 萍等．鸭疫里氏杆菌分离及免疫研究．上海农业学报，2003，19(4)：109～111）。由于本病的 高死亡率，致鸭体重减轻和高度淘汰，使其成为养鸭业经济损失最主要的疾病之一。使用疫 苗进行免疫接种是控制该病的方法之一。到目前为止，鸭传染性浆膜炎共报道有21个血清型 （1～21型），由于鸭传染性浆膜炎血清型较多，且各血清型之间没有交叉保护（Sandhu T S, Leister M L.Serotype of Pasteurella anatipestifer isolates from poultry in different contries.Avian  Pathology,1991,20:232-239），所以，使用疫苗的抗原血清型必须与发生该病的血清型最大程 度的吻合，才能达到最佳免疫效果。

目前，对鸭传染性浆膜炎的防治主要以疫苗预防为主。由于鸭传染性浆膜炎不同血清型 菌株的免疫原性不同，菌苗诱导的免疫力具有血清型的特异性，而且本病可出现多种血清型 混合感染以及血清型的变异，因此，使用疫苗时，在确定不同地区流行菌株的血清型及其分 布基础上，选用同型菌株的疫苗才能确保免疫效果。

鸭传染性浆膜炎给养鸭业带来严重的经济损失，引起越来越多的关注。目前，鸭传染性 浆膜炎较为理想的疫苗应该是亚单位苗或基因工程苗，而作为兽用疫苗，亚单位苗由于成本 过高而不太实用，基因工程苗则是较为理想的发展方向。在研制基因工程苗时，在亲本株的 选择上，要么是分离本地毒力较强的优势血清型，产生最大限度的保护；要么使用的疫苗含 有多种血清型，尽可能地包括多种保护性抗原，可以提供更全面的保护。但现在科研人员对 RA的研究都集中在细菌的结构与功能上，细菌的致病机制等分子水平的研究虽然取得了很大 的进展，但研究成果还未能促使RA疫苗取得突破。目前国内只有四川农业大学研制的疫苗获 得了新兽药注册证书，但是他们研究的产品仅含血清1型鸭疫里默氏杆菌，不能预防其它血清 型引起的鸭传染性浆膜炎，市场急需多价苗的推广与应用。

鉴于上述原因，根据近几年的流行病学调查和病原分离工作，特别是目前企业的实际生 产能力和水平，我们认为利用多个血清型的流行菌株研制鸭传染性浆膜炎疫苗符合需要，并 能够解决以往产品无法预防多个血清型引发鸭传染性浆膜炎的问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供本发明人自行分离的的三株不同血清型鸭疫里默氏杆菌 血清1型ZJ01株、血清2型HN01株、血清7型YC03株，利用三株菌株制备一种鸭传染性 浆膜炎三价灭活疫苗，用于有效预防鸭传染性浆膜炎。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案在于：

将保藏号为CGMCC No.6400的血清1型鸭疫里默氏杆菌ZJ01株、保藏号为CGMCC No. 6398的血清2型鸭疫里默氏杆菌HN01株和保藏号为CGMCC No.6399的血清7型鸭疫里默 氏杆菌YC03株作为生产疫苗用菌种，分别接种马丁肉汤培养基，于37℃培养16～20小时， 经过灭活、浓缩制成三种灭活浓缩菌液；将检验合格的三种灭活浓缩菌液混合，加入油佐剂 再经乳化制备出鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗。

具体实施方式

1.疫苗生产用菌株

（1）菌株来源

本发明人于2006年从河南、山东和浙江等地鸭场采集鸭疫里默氏杆菌病病料，用血清营 养琼脂平板从病死鸭的脑组织、心脏、肝脏等部位分离出多株鸭疫里默氏杆菌菌株，对分离 的鸭疫里默氏杆菌进行了形态观察、培养特性、生化特性、血清学试验、毒力和免疫原性试 验，最终筛选到国内流行的血清1型、2型菌株和7型菌株各一株，分别命名为鸭疫里默氏 杆菌血清1型ZJ01株、血清2型HN01株和血清7型YC03株。以上鸭疫里默氏杆菌（Riemerella  anatipestifer）1型ZJ01株，2型HN01株和7型YC03株已于2012年08月14日送交北京市 朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏，编号为分别：CGMCC No.6400，CGMCC No.6398和CGMCC No.6399。

（2）菌种特性

1）形态及生化特性本菌为革兰氏阴性小杆菌。感染动物的组织或血液涂片，瑞氏染色 为两极着色小杆菌。生化特性符合细菌分类学中本菌的特性。

2）培养特征在麦康凯琼脂平板上不生长；在含5%新生牛血清的营养琼脂平板、含10% 绵羊鲜血的营养琼脂平板和马丁肉汤培养基中生长良好；在含5%新生牛血清的营养琼脂平板 上培养24小时，形成圆形、凸起、透明、呈露珠样、直径为0.5mm～1.5mm的菌落，用斜射 光观察有蓝色荧光；在含10%绵羊鲜血的营养琼脂平板上呈露珠样小菌落，不溶血；在马丁 肉汤培养基中均匀浑浊，无菌膜。

3）分型鉴定

①材料

鸭疫里默氏杆菌定型血清琼扩效价均≥1:16，由扬州大学兽医学院保存、提供。

待检菌株鸭疫里默氏杆菌ZJ01株、HN01株、YC03株，由齐鲁动物保健品有限公司 分离、提供。

②方法

在室温条件下，将鸭疫里默氏杆菌ZJ01株、HN01株、YC03株抗原分别充分振荡摇匀 后，吸取25μl滴于洁净载玻片上，分别取定型血清25μl与之混匀。抗原和血清混合后观察5 min，若出现明显的颗粒凝集或块状凝集则为阳性，若不出现凝集则为阴性。

③结果

凝集反应结果表明，鸭疫里默氏杆菌ZJ01株与1型定型血清产生凝集反应，判定为血清 1型；HN01株与2型定型血清产生凝集反应，判定为血清2型；YC03株与7型定型血清产 生凝集反应，判定为血清7型菌株。具体结果见表1。

表1鸭疫里默氏杆菌血清型鉴定试验结果

④结论

经凝集试验鉴定，鸭疫里默氏杆菌ZJ01株为血清1型；HN01株为血清2型；YC03株 为血清7型菌株。

4）分子生物学鉴定根据GenBank发表的RA 16SrRNA保守序列设计一对引物，上游 引物序列为5’-ATTAGTATTGAAAGCTCCG-3’；下游引物序列为 5’-TCCGAAGAAAACCGTATT-3’，经PCR扩增出800bp特异目的条带，经序列测定、同源 性分析和Blast比较，结果表明3株菌株的序列同源性100%，与GenBank中收录的RA相应 序列亦一致，同源性为100%。说明该3株菌种均为RA菌株。

5）毒力分别用一个最小发病剂量的菌液肌肉注射4周龄健康易感鸭（平板凝集试验抗 体阴性）10只，观察7日，均8/10以上发病。

6）免疫原性为了疫苗研究，对三株菌株分别进行了免疫原性试验，免疫雏鸭，进行攻 毒，结果显示三株菌株具有良好的免疫原性。同时比较了三个菌株传代的P5、P10、P15代 菌的免疫原性后，结果并无太大差异，因此选取P5～P10代作为基础菌种，生产种子继代不 超过5代。

2.鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗的生产制备

（1）以鸭疫里默氏杆菌ZJ01株、HN01株和YC03株作为疫苗生产用菌种，马丁肉汤培 养基为生产用培养基，分别在发酵罐中进行培养；

（2）发酵罐中装入适量的马丁肉汤培养基和消泡剂，灭菌后按培养基总量的0.1%加入 新生牛血清，并按培养基总量的5%接入制备好的二级种子液，37℃培养约18小时；

（3）菌液培养完成后，取样分别进行纯粹检验和活菌计数。按照菌液总量的0.2%加入 甲醛溶液，37℃灭活24小时。将灭活检验合格的菌液通过离心的方法浓缩，待检备用；

（4）将经半成品检验合格后的3种浓缩菌液按等体积混合菌液制备水相，按水相与油相 2:1（体积比）的乳化；乳化成鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗。

3.鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗检验方法

（1）性状

外观应为乳白色乳剂。

剂型油包水型。取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相应不 多于0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》（中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典，二〇一〇年 版三部.中国农业出版社，2011，本发明简称为“现行《中国兽药典》”）规定方法进行检 验，应符合规定。

（2）无菌检验

按现行《中国兽药典》规定方法进行检验，应无菌生长。

（3）安全检验

用1周龄健康易感鸭（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝集试验抗体阴性）10只，各颈 部皮下注射疫苗0.4ml，观察14日，应健活。

用7～10日龄健康易感鸭（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝集试验抗体阴性）30只， 各颈部皮下注射疫苗0.2ml，另取30只作对照。免疫后21日，取10只免疫鸭和10只对照鸭， 各腿部肌肉注射一个最小发病剂量的ZJ01株菌液；另取10只免疫鸭和10只对照鸭，各腿部 肌肉注射一个最小发病剂量的HN01株菌液；其余10只免疫鸭和10只对照鸭各腿部肌肉注 射一个最小发病剂量的YC03株菌液。攻毒后观察10日，对照组均应至少9只发病，免疫组 均应至少9只保护。

（5）甲醛、汞类防腐剂残留量测定

按现行《中国兽药典》规定方法进行测定，应符合规定。

4.疫苗与同类疫苗的比较

疫苗A：本发明提供的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗；

疫苗B：商品化鸭传染性浆膜炎灭活疫苗（为1型、2型二价苗）国内厂家生产；

疫苗C：本发明人制备的1型鸭传染性浆膜炎灭活疫苗；

疫苗D：本发明人制备的2型鸭传染性浆膜炎灭活疫苗；

疫苗E：本发明人制备的7型鸭传染性浆膜炎灭活疫苗；

（1）鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗与三种不同血清型单苗免疫攻毒比较

用1周龄健康易感樱桃谷鸭（鸭疫里默氏杆菌1型、2型、7型平板凝集试验抗体阴性） 150只，随机分成5个大组，每个大组随机分成3个小组。免疫剂量为1羽份（0.2ml）/只， 免疫后21日，试验鸭各腿部肌肉注射攻毒，攻毒剂量为一个最小发病剂量的菌液。具体免疫、 攻毒方式见表2：

表2免疫、攻毒方式

结果表明，免疫A疫苗的试验鸭（1组）对三个血清型攻毒保护率分别为10/10、9/10、 10/10，免疫C、D、E疫苗的试验鸭，对不同血清型的强毒攻击无免疫交叉保护，具体试验 结果见表2。

（2）血清型1型菌株免疫效果比较

用1周龄健康易感樱桃谷鸭（鸭疫里默氏杆菌1型平板凝集试验抗体阴性）30只，随机 分成3组，第1组10只各颈部皮下注射A疫苗1羽份（0.2ml），第2组10只各颈部皮下注 射B疫苗1羽份（0.25ml），第3组10只不免疫作为对照。免疫后21日，所有试验鸭各腿 部肌肉注射一个最小发病剂量的血清1型ZJ01株菌液，观察10日，记录试验鸭发病情况。

结果表明，免疫A疫苗的试验鸭攻毒保护效果为10/10，免疫B疫苗的试验鸭攻毒保护 为9/10，对照10/10发病，具体结果见表3。

表3血清型1型菌株免疫效果比较试验结果

附图说明

图1鸭疫里默氏杆菌PCR产物电泳结果（M:Marker DL2000；1:阴性对照；2:血清1 型ZJ01株；3:血清2型HN01株；4:血清7型YC03株；5:鸭源大肠杆菌；6:鸭源沙门氏菌； 7:鸭巴氏杆菌；8:葡萄球菌；9:链球菌）

图2鸭疫里默氏杆菌血清1型ZJ01株、血清2型HN01株、血清7型YC03株16SrRNA 序列同源性

本发明涉及的微生物菌种

本发明涉及到的鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）1型ZJ01株，2型HN01株和 7型YC03株已于2012年08月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号分别为：CGMCC No.6400，CGMCC No.6398和CGMCC No.6399。

本发明的积极意义

本发明提供一种鸭传染性浆膜炎灭活疫苗。该疫苗是利用由本发明人自行分离的三株不 同血清型鸭疫里默氏杆菌：血清1型ZJ01株、血清2型HN01株、血清7型YC03株，分别 接种适宜培养基培养，收获培养物，经甲醛溶液灭活后浓缩，然后按照一定比例混合均匀， 加入矿物油佐剂乳化制得。该疫苗能够有效预防1型、2型、7型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传 染性浆膜炎，并有以下优点：

1.本发明涉及到的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，生产用菌株是三个血清型的鸭疫里默 氏杆菌，保护范围涵盖了1型、2型、7型鸭疫里默氏杆菌引起的鸭传染性浆膜炎。

2、本发明涉及到的鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗，免疫后保护率可达9/10以上。

实施例

以下实施例进一步说明本发明。

实施例1

——生产菌种

1.菌种的纯粹检验

将菌种接种含5%新生牛血清的营养琼脂平板，37℃培养24小时，形成圆形、凸起、透 明、呈露珠样、直径为0.5mm～1.5mm的菌落，用斜射光观察有蓝色荧光。

2.毒力

1）血清1型ZJ01株取4周龄健康易感鸭10只（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝 集试验抗体阴性），肌肉注射一个最小发病剂量的菌液（约含活菌数1.0×10⁷CFU），观察 10日，全部发病。

2）血清2型HN01株取4周龄健康易感鸭10只（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝 集试验抗体阴性），肌肉注射一个最小发病剂量的菌液（约含活菌数5.0×10⁷CFU），观察 10日，全部发病。

3）血清7型YC03株取4～5周龄健康易感鸭10只（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板 凝集试验抗体阴性），肌肉注射一个最小发病剂量的菌液（约含活菌数1.0×10⁷CFU），观 察10日，全部发病。

实施例2

——疫苗制造

1.制苗用培养基配制马丁肉汤培养基液体培养基。

2.生产用种子制备

1）一级种子的繁殖及鉴定将菌种接种于含5%新生牛血清的马丁肉汤中，37℃培养20 小时，然后划线接种于含5%新生牛血清的营养琼脂平板上，37℃培养30小时，然后选取8 个典型菌落，分别划线接种于含10%绵羊鲜血的营养琼脂斜面若干支，37℃培养30小时，作 为一级种子。

2）二级种子繁殖将一级种子接种于含1%新生牛血清的马丁肉汤培养基，置37℃培养 20小时，经纯粹检验合格后作为二级种子。

3.制苗用菌液制备

发酵罐中装入适量的马丁肉汤培养基和消泡剂，灭菌后按培养基总量的0.1%加入新生牛 血清，并按培养基总量的5%（体积比）接入二级种子液，于37℃培养约18小时。菌液培养 完成后，取样分别进行纯粹检验和活菌计数。按照菌液总量的0.2%加入甲醛溶液，37℃灭活 24小时，间隔7小时搅拌一次。灭活结束后，取样进行灭活检验。灭活检验合格的菌液通过 离心的方法浓缩，使ZJ01株菌液菌数达到2.35×10¹⁰CFU/ml、HN01株菌液菌数达到4.70× 10¹⁰CFU/ml、YC03株菌液菌数达到2.35×10¹⁰CFU/ml，即为半成品。

4.油佐剂配制、配苗及乳化

油相制备取兽用白油94份，硬脂酸铝2份，置于油相制备罐中加热至80℃后，再加 司本－806份，至温度达到115℃时，维持30min，冷却后备用。

水相制备将以上检验合格的3种浓缩菌液（半成品）按等体积混合的菌液96份，与灭 菌后的吐温-804份(体积比)混合后，使吐温-80完全溶解，制备水相。

乳化取油相2份(体积比)置乳化罐中，开动电机搅拌，同时徐徐加入水相1份，加完 后以3000r/min乳化50分钟即可。乳化后，取10ml，以3000r/min离心15分钟，管底析出 的水相≤0.5ml。

5.分装、贴签、入库保存。

实施例3

——疫苗的成品检验

（1）性状

外观应为乳白色乳剂。

剂型油包水型。取1清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均不扩散。

稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15min，管底析出的水相小于 0.5ml。

黏度按现行《中国兽药典》规定进行，黏度为42cp。

（2）无菌检验按现行《中国兽药典》规定方法进行检验，均无菌生长。

（3）安全检验用1周龄健康易感鸭（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝集试验抗体阴 性）10只，各颈部皮下注射疫苗0.4ml，观察14日，均健活。

（4）效力检验用7～10日龄健康易感鸭（鸭疫里默氏杆菌1、2、7型平板凝集试验抗 体阴性）30只，各颈部皮下注射疫苗0.2ml，另取30只作对照。免疫后21日，取10只免疫 鸭和10只对照鸭，各腿部肌肉注射一个最小发病剂量的ZJ01株菌液；另取10只免疫鸭和 10只对照鸭，各腿部肌肉注射一个最小发病剂量的HN01株菌液；其余10只免疫鸭和10只 对照鸭各腿部肌肉注射一个最小发病剂量的YC03株菌液。攻毒后观察10日，对照组均全部 发病，免疫组全部保护。

（5）甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》规定方法进行测定，甲醛残 留量≤0.2%，汞类防腐剂残留量≤0.01%。

实施例4

——疫苗的安全性试验

1.用1周龄健康易感鸭40只，随机分成4组，每组10只，第1、2、3组分别颈部皮下 接种001批、002批、003批3批三价疫苗，0.4ml/只，第4组作为对照，观察14日。

3批疫苗一次超剂量（2羽份）接种1周龄雏鸭后观察14日，30只接种鸭全部健活；无 异常临床症状；注射局部无红肿、炎症、坏死、溃疡等现象，剖检未见异常病理变化。接种 鸭与对照鸭各项指标未见明显区别。

2.对鸭生长性能的影响

用1周龄健康易感樱桃谷鸭40只随机分成2组，每组20只，分别称重并编号。第1组 分别颈部皮下接种200702批疫苗，每只0.2ml，第2组作为对照。观察14日，记录试验鸭的 临床反应并分别称重，考察疫苗是否对鸭生长性能存在影响。

接种鸭与对照鸭免疫前体重分别为0.21±0.02kg和0.20±0.02kg，接种后14日体重分别 为1.23±0.05kg和体重1.24±0.03kg，增重分别为1.02±0.04kg和1.03±0.04kg。将增重进行 差异性分析，P值计算结果为0.48（P＞0.05），因此差异不显著。结果表明，本疫苗对鸭生 长性能无不良影响。

实施例5

——疫苗效力试验

用1周龄健康易感樱桃谷鸭300只，随机分成4组，第1、2、3组每组90只，分别颈部 皮下免疫按本发明以上方法制备的001批、002批和003批鸭传染性浆膜炎三价灭活疫苗， 第4组30只作为对照。每批疫苗分0.05ml/只、0.1ml/只和0.2ml/只三个剂量分别进行免疫， 每个剂量免疫30只试验鸭。免疫后21日，将免疫鸭和对照鸭各随机平均分成3组，分别腿 部肌肉注射一个最小发病剂量的ZJ01株、HN01株、YC03株菌液。观察10日，记录试验鸭 的发病情况。

免疫0.05ml疫苗对血清1型ZJ01株、血清2型HN01株、血清7型YC03株的保护率分 别为46.7%（14/30）、43.3%（13/30）和43.3%（13/30）。免疫0.1ml疫苗对血清1型ZJ01 株、血清2型HN01株、血清7型YC03株的保护率分别为90%（27/30）、90%（27/30）、 93.3%（28/30）。免疫0.2ml疫苗对血清1型ZJ01株、血清2型HN01株、血清7型YC03 株的保护率分别为100%（30/30）、100%（30/30）、100%（30/30），对照鸭均90%（9/10） 以上发病。说明免疫0.1ml疫苗对3种血清型的保护率均在90%以上，因此，该三价疫苗的 最小免疫剂量为0.1ml/只。具体试验结果见表4。

表4鸭疫里默氏杆菌病1、2、7型三价灭活疫苗最小免疫剂量试验结果

以上结果表明，该三价疫苗的最小免疫剂量为0.1ml/只，建议实际应用建议0.2ml/只（1 羽份），因此出厂疫苗标准规定每羽份疫苗含有灭活的血清1型、2型和7型鸭疫里默氏杆 菌，每羽份中含灭活前活菌数分别为血清1型ZJ01株≥5×10⁸CFU/ml、血清2型HN01株≥ 1×10⁹CFU/ml、血清7型YC03株≥5×10⁸CFU/ml。