单核苷酸多态性rs2735591在检测麻风病易感基因中的应用

摘要

本发明公开了单核苷酸多态性rs2735591在检测麻风病易感基因中的应用。本发明所保护的一个技术方案是检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型的物质在制备检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用。可将检测rs2735591的多态性的物质与其它物质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者的产品。

说明书

技术领域

本发明涉及单核苷酸多态性rs2735591在检测麻风病易感基因中的应 用。

背景技术

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)指基因组单个 核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、 插入或缺失所形成的变异形式。单核苷酸多态性是基因组上高密度的遗传 标志，在人类基因组中已发现的SNP数量超过3000万。作为第三代遗传 标记SNP数量众多、分布密集，易于检测，因而是理想的基因分型目标。 SNP分型检测在疾病基因组(如疾病易感性)，药物基因组(药效、药物代谢 差异和不良反应)和群体进化等研究中具有重大意义。

目前已有多种方法可用于SNP检测,如DNA测序、限制性酶切片段长 度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱、SNP芯片。其中，SNP 芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等 位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引 物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合 反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片（张小燕等。用基因 芯片检测单核苷酸多态性反应原理。中国生物工程杂志。2005,25(11):52～ 56）。

麻风病是一种由麻风分枝杆菌感染所致的慢性传染病，在发展中国家 这仍然是一个严重的健康问题，每年全球新发病例数为250000。主要侵犯 皮肤和外周神经，并导致不可逆性的神经功能损害和慢性致畸致残。这已 被证明在麻风的流行中环境因素和宿主遗传因素起着至关重要的作用，估 计遗传因素高达57%。

世界卫生组织的方案把麻风病的临床表现分为结核型和瘤型，分别对 应了Th1（细胞介导）和Th2（体液介导）组织的人体的免疫应答。麻风 病多样性的临床表现反映出人体对同种病原体的两种截然不同的免疫应 答，这就说明遗传易感性在麻风发病中的重要性。遗传研究的结果表明遗 传与麻风易感性和其临床亚型的病情进展都有关联。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供单核苷酸多态性rs2735591在麻风 病方面的新用途。

本发明所提供的新用途是下述1）-9）中的至少一种：

1）检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型的物质在制备检测 与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

2）检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型的物质在制备鉴定 或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品中的应用；

3）检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型的物质在制备筛查 麻风病患者产品中的应用；

4）检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型的物质在制备检测 麻风病易感性产品中的应用；

5）人基因组中的单核苷酸多态性在制备检测麻风病易感基因的产品 中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为rs2735591的DNA 序列多态性；

6）人基因组中的单核苷酸多态性在制备鉴定或辅助鉴定麻风病易感 基因的产品中的应用，其中，所述单核苷酸多态性是refSNP ID为 rs2735591的DNA序列多态性；

7）人基因组中rs2735591的多态性在制备筛查麻风病患者产品中的 应用；

8）人基因组中rs2735591的多态性在制备检测麻风病易感性产品中 的应用；

9）包括检测人基因组中rs2735591多态性的物质的产品，为a)-d) 中的任一种产品：

a）检测与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，

b）鉴定或辅助鉴定与麻风病相关的单核苷酸多态性的产品，

c）筛查麻风病患者产品，

d）检测麻风病易感性产品。

在本发明的实施例中，所述麻风病具体为中国汉族人群麻风病。

rs2735591是人染色体1p 22上的一个二等位多态性的SNP位点，该 变异是转换(C/T，在其互补链上则为G/A)。所述rs2735591基因型是 CC、CT或TT。所述CC是rs2735591位点为C的纯合型，所述TT是rs2735591 位点为T的纯合型，所述CT是rs2735591位点为T和C的杂合型。所述 检测人基因组中rs2735591的多态性或基因型具体可为检测rs2735591的 核苷酸种类。

实验证明，rs2735591在由3148个麻风病患者组成的病例群体和由 7843个正常人组成的病例对照群体的P值是1.03×10^-9,相对危险度是1.24， 说明rs2735591是与麻风病相关的单核苷酸多态性。距离rs2735591 2kb 的BCL10经实验证明是一种新的麻风病易感基因，另外在rs2735591的连 锁区域还发现两个候选的易感基因：C1orf52和DDAH1。C1orf52和DDAH1 与BCL10相毗邻。

实验证明，rs2735591的三个基因型中，CC基因型的个体在正常人群 体中的比例是49.2%，明显高于麻风病患者群体中的比例39.9%。在实际 应用中，可将检测rs2735591的多态性的物质与其它物质（如检测其它的 与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制备筛查麻风病患者 的产品。

其中，检测人基因组中rs2735591的多态性的物质可为通过下述至少 一种方法确定rs2735591的多态性所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制 性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。 其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯 片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯 片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白 DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。

所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产 品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，由PCR试剂和DNA测序试剂 和DNA测序仪组成的组合产品。

本发明的一个实施例中，采用PCR引物扩增包括rs2735591在内的基 因组DNA片段，以得到的PCR扩增产物为模板，采用单碱基延伸引物进行 单碱基延伸反应，对得到的延伸产物的序列进行检测，确定rs2735591的 多态性和基因型。所述PCR引物在序列上没有特殊要求，只要能扩增出包 括rs2735591在内的基因组DNA片段即可，具体可为序列1和序列2所示 的单链DNA。所述延伸引物根据人基因组中rs2735591上游（不包括该SNP 位点）设计，所述延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中rs2735591 的前1位核苷酸，如所述延伸引物具体可为TCCCTGTTTTATTTTTTCCTCTTAG （序列表中的序列3），当然也可将序列3所示的单链DNA按照人基因组中 rs2735591的上游序列延长一个以上核苷酸，或按照人基因组中rs2735591 的上游序列缺失一个以上核苷酸，只要能使该单碱基延伸引物的3′末端 延伸出rs2735591位点的核苷酸即可。

本发明基于GWAS数据，以Toll和CARD为候选基因研究单核苷酸多 态性与中国汉族人群麻风病遗传易感性的关系，发现rs2735591是与麻风 病相关的单核苷酸多态性。可将检测rs2735591的多态性的物质与其它物 质（如检测其它的与麻风病相关的单核苷酸多态性的物质）联合在一起制 备筛查麻风病患者的产品。

附图说明

图1为rs2735591的关联区域。

左侧纵轴显示为SNP的P值，右侧纵轴显示为重组率，横轴显示其物 理位置，三角形所示的SNP为rs2735591。重组率的估算基于千人基因组 中中国及日本人群样本。图中注释的基因源于 (http://genome.ucsc.edu/)。

图2为BCL10在病损组织和正常组织中的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施 例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径 得到。

实施例1、rs2735591是与麻风病相关的单核苷酸多态性

2009年发明人所在研究小组采用全基因组关联研究（GWAS）在中国汉 族人群中发现了麻风病的7个易感基因(CCDC122，C13orf31,NOD2, TNFSF15,HLA-DR、RIPK2和LRRK2)，其中5个基因以NOD2为中心建 立起一个信号通路(Zhang,F.R.,Huang,W.,Chen,S,M.,Sun,L.D.,Liu, H.,Li,Y.,Cui,Y.,Yan,X.X.,Yang,H.T.,Yang,R.D.et  al.(2009)Genomewide association study of leprosy.N.Engl.J.Med., 361,2609-2618.)，2011年继GWAS后又发现了2个麻风易感基因(IL23R和 RAB32)(Zhang,F.,Liu,H.,Chen,S.,Low,H.,Sun,L.,Cui,Y.,Chu, T.,Li,Y.,Fu,X.,Yu,Y.et al.(2011)Identification of two new  loci at IL23R and RAB32 that influence susceptibility to leprosy.Nat. Genet.,43,1247-1251.)。麻风病作为一类多个微效基因共同起作用的复 杂性疾病,目前发现的9个易感基因位点仅是其易感基因谱的冰山一角,更 多的麻风易感基因尚待进一步发现。

伦理声明

本研究通过了山东省医学科学院皮肤病与性病学研究机构伦理委员 会批准，所有麻风病患者及正常对照者均签署了知情同意书。

研究对象

来自中国汉族人群的三个独立样本，这三个独立样本中共有3148名 麻风病患者，7843名正常对照者。他们均为无血缘关系的独立个体。临床 分型、家族史情况及发病年龄等信息通过病历采集。样本均通过标本的质 控。所有的麻风病患者及正常对照者均来自中国北方，年龄、性别及籍贯 均相匹配。麻风病患者的诊断至少由两名皮肤科专家同时确诊（临床依据 包括爪形手、畸形足及病理依据等）。正常对照者均无麻风家族史及其他 面议疾病病史。

独立样本1由706名麻风病患者病例及514名正常对照者组成；独立 样本2（验证样本1）共1504名麻风病患者及1502名正常对照者；独立 样本3（验证样本2）共938名麻风病患者及5827名正常对照者。

其中，中国麻风病患者的诊断标准是符合下述4条中的2条或2条以 上，或符合第3条者确立诊断：1、皮损伴有感觉障碍及闭汗，或有麻木 区；2、周围神经受累，表现为神经干粗大伴相应功能障碍；3、皮损组织 切片或组织液涂片查到麻风杆菌；4、病理可见特征性改变。

正常对照者的诊断标准：无麻风病史及其他传染病病史,无其他自身 免疫性疾病病史及家族史。

表1显示了验证样本1和验证样本2的基本信息。

表1、2442名中国麻风病患者和7329名正常对照者的基本情况

第一阶段的研究使用了发明人所在课题组以往研究报道的全基因组 关联分析的数据（Zhang,F.R.,Huang,W,Chen,S,M.,Sun,L.D.,Liu,H.,Li, Y.,Cui,Y.,Yan,X.X.,Yang,H.T.,Yang,R.D.et al.(2009)Genomewide  association study of leprosy.N.Engl.J.Med.,361,2609-2618），该数据来自独 立样本1；第二阶段为验证，使用了另一个独立样本（验证样本1）共1504 名麻风病患者及1502名正常对照者，第三阶段为进一步验证，使用了第 三个独立样本（验证样本2）共938名麻风病患者及5827名正常对照者。

候选基因及SNP的选择

登陆(http://genome.ucsc.edu/)，输入“TOLL、CARD”关键词，共 搜寻到来自TOLL家族37个基因及来自CARD家族53个基因，去除重复区 域后，共有69个候选基因被选出，在每个候选基因的上下游各扩选出20KB 距离。第一阶段在发明人所在课题组前期发表Zhang,F.R.,Huang,W.,Chen, S,M.,Sun,L.D.,Liu,H.,Li,Y.,Cui,Y.,Yan,X.X.,Yang,H.T.,Yang,R.D.et  al.(2009)Genomewide association study of leprosy.N.Engl.J.Med., 361,2609-2618的GWAS数据中，从独立样本1（以往GWAS样本（包括1220 样本，706个麻风病患者病例及514个正常对照）研究中的数据结果中挑 选位于以上区域的相关位点，在这两个GWAS数据库中，总共有69个候补 基因的4363个SNPs被分析。通过以下标准来鉴别能够提示相关证据的 SNPs：a）在扩展GWAS分析中，P值的关联性小于1.0×10^-2；b）在706 例病例和514例匹配对照的第一次GWAS分析，以及对706例病例和5581 例人群对照的扩展GWAS分析里，P值的关联性有所改善（至少降低10^-1）。 总计，在2个Toll样受体(ZCCHC11和FREM1)以及6个CARD基因(BCL10、 KCNQ1、MAP2K1、CARD14、NOD1和VISA)中的8个提示SNPs候补基因被识 别，并用于进一步的验证分析。

在第二阶段的第一次验证分析中，8个挑选出的SNPs中有6个在验证 样本1的1504例麻风病例和1502个正常对照中被基因分型成功，然而另 外两个SNPs无论在试验设计还是在基因型分析中都失败了。6个SNPs的 关联性结果见表2。在这6个SNPs中，2个表示出有效关联性（在校正了 6个SNP后，p<0.005）：rs2735591(P=2.18×10^-6，OR=1.32)和rs4889841 (P=6.94×10^-4,OR=1.20)。在第二次验证分析中（第三阶段），这两个SNPs 在验证样本2的938例麻风病患者病例和5827例正常对照者中被进一步 基因定位。Rs2735591在第二次的验证样本中显示出有效的关联性(P=4.58 ×10^-3,OR=1.17)，但是rs4889841没有显示出以往的有效关联性(P=4.75 ×10^-2,OR=0.89)（表3）。Rs2735591在两个独立验证和已经发布的GWAS 样本中显示出一致的相关性，但无遗传异质性（p>0.05）（表3）。rs2375591 区域在已验证的样本中有高度关联性(P=1.27×10^-7，OR=1.27)，即使在 校正后4363个位点已经在现在的研究中验证(Pcorrected=5.54×10^-4)并 且在全部样本（联合GWAS和独立验证样本）中超过了全基因组数据(P=1.03 ×10^-9,OR=1.24)，包含了总共的3148个麻风病患者病例和7843个控制 子（正常对照者）（表3）。

表2.有关联性的6个SNP

a:次要/主要等位基因

b:GWAS对照中次要等位基因频率

c:数据来源于Zhang,F.R.,Huang,W.,Chen,S,M.,Sun,L.D.,Liu,H.,Li,Y.,Cui,Y.,Yan,X.X., Yang,H.T.,Yang,R.D.et al.(2009)Genomewide association study of leprosy.N.Engl.J.Med., 361,2609-2618.

d:数据来源于Zhang,F.,Liu,H.,Chen,S.,Low,H.,Sun,L.,Cui,Y.,Chu,T.,Li,Y.,Fu,X.,Yu,Y. et al.(2011)Identification of two new loci at IL23R and RAB32 that influence susceptibility to  leprosy.Nat.Genet.,43,1247-1251.

表3、rs2735591在麻风病患者和正常对照者中的关联分析结果

a:数据来源于Zhang,F.R.,Huang,W.,Chen,S,M.,Sun,L.D.,Liu,H.,Li,Y.,Cui,Y.,Yan,X.X.,Yang,H.T., Yang,R.D.et al.(2009)Genomewide association study of leprosy.A.Engl.J.Med.,361,2609-2618.

b:包括验证样本1和验证样本2的所有样本。

c:包括验证样本1、验证样本2和GWAS样本的三个独立样本。

其中，基因分型的方法如下：

8个SNPs采用Sequenom MassArray(San Diego,USA)平台验证，每个样本约用到 15ngDNA。首先提取外周血的基因组DNA，标准化后，样本DNA经多重PCR反应扩增包 括SNP位点在内的基因组DNA片段，扩增产物进行SNP位点特异性单一链的延伸，延 伸产物脱盐并转移到384孔的芯片上。质谱仪（MALDI-TOF MS）进行等位基因的检测， 采用Sequenom MassARRAY分型软件对检测结果进行分析。每个验证样本去除call rate<95%的SNP，次要等位基因频率＜0.01者或在对照中根据遗传平衡定律P＜0.01 者。

1、全血标本采集

在知情同意，并签署书面同意书的情况下采集研究对象外周静脉血5ml，放置于 EDTANa₂抗凝管中，置-80℃冰柜储存备用。

2、DNA浓度标准化包括如下步骤：

1）利用NanoDrop-1000浓度测试仪准确测定每一份需要标准化的样本DNA浓度和 OD比值（A260/A280、A260/A230）。

2）建立电子表格，排定每个样本孔需要加入的DNA编号。

进行Sequenom MassArray分型的样本，在每96孔板上留有空白对照和重复样本对 照。

3）按照电子表格的顺序，加入已测定浓度的DNA。

对于进行Sequenom MassArray分型的样本要求实验浓度为12-30ng/μl，一般以 18ng/μl为佳。并且A260/A280比值介于1.5-2.0之间、A260/230介于1.5-2.3， 如DNA浓度高于18ng/ul则加入适量FG3，将浓度标化至18ng/ul；如DNA浓度低于 12ng/ul，则重新从血液提取合格的DNA。浓度在12—18ng/μl间直接加入。

离心后贴上粘性锡箔纸，并用标记笔标上样本板标号、样本类型、来源地等信息。

4）在平板离心机上，3000g离心3分钟，存放于-20℃备用。

3、多重PCR

其中，多重PCR中扩增包括rs2735591在内的基因组DNA片段的引物如下：

ACGTTGGATGCTCATCCTACTTCCCTGTTT（序列表中的序列1）和

ACGTTGGATGCACGCCTGGCTATATCTAAG（序列表中的序列2）。

4、SNP位点特异性单一链的延伸反应

其中，延伸引物根据人基因组中SNP位点上游（不包括该SNP位点）设计，所述 延伸引物的最后1位核苷酸对应于人基因组中该SNP位点的前1位核苷酸。rs2735591 的延伸引物的序列是TCCCTGTTTTATTTTTTCCTCTTAG（序列表中的序列3）。

5、数据质量控制

1)对分型的SNP进行call rate计算，去除call rate<90%的SNP或等位基因频 率<0.01的SNPs;

2)对SNP进行遗传平衡检验，去除偏离遗传平衡定律的SNP（对照样本中 Hardy-Weinberg平衡检验的P≦0.001）；

3)在Sequenom MassArray系统中查看SNP的分型聚类图，去除聚类图分堆不清的 SNP。

4)样本质控：直接去除分型失败的样本。

将通过质控的样本和SNP进行统计分析。

6、数据统计分析

利用Plink 1.07软件对分型成功并通过质控的SNP在病例组和对照组做基因表型 相关性分析，两个独立验证样本（验证样本1与验证样本2）中，基因型一表型关联 研究采用Cochran—Armitage趋势检测。在联合样本（独立样本1+验证样本1+验证样 本2）中采用Cochran–Mantel–Haenszel进行检测。多重logistic回归分析用于检 测区域内的信号的独立性。检验水准α以0.05除以通过质量控制的SNP数目为检验水 准。Q检验用于评估遗传异质性的显著性，对SNP校正检测后P值小于0.05者视为有 显著遗传异质性。

rs2735591的基因型和表型关联研究结果如表4所示，表明rs2735591是与麻风病相关 的单核苷酸多态性。

表4.rs2735591的基因型和表型关联研究结果

通过在三组独立样本中的关联研究，确定rs2735591是与麻风病相关的单核苷酸 多态性，其距离BLC10（B细胞淋巴瘤/白血病-10）基因2Kb。Rs2735591存在于1p22 上一个约400kb大小的连锁不平衡区域，这个区域同时有BCL10和其他少数几个基因 和转录子。除了BCL10，在这个连锁区域还有其他几个易感基因。C1orf52和DDAH1 与BCL10相毗邻。DDAH1编码与一氧化氮合成有关的酶，C1orf52可能是没有功能的基 因。

实施例2、BLC10基因在麻风病的发病中起着重要作用

为验证BLC10基因是否为转录表达的潜在主调控基因，对rs2735591进行eQTL 分析，从山东省皮肤病性病防治研究所病理科保存的蜡块资源库中选取确诊的麻风病 标本36例。正常对照标本32例取自山东省皮肤病性病防治研究所外科手术切除标本 边缘的正常皮肤，经组织病理学确认为正常皮肤。以上标本全部经福尔马林固定-石蜡 包埋。采用Branched-chain DNA的方法，通过荧光探针对mRNA进行杂交，进而检测 经过三级放大的荧光信号确定BCL10基因在组织中的表达量，其中使用管家基因PPIB 基因（GenBank Accession Number NM_000942）和HPRT1基因（NM_000194）作为 内对照基因进行相对表达量分析。应用SPSS13.0软件进行统计学处理实验数据。结果 表明BCL10的表达量在病损组织中明显低于正常组织（P=0.0007）(图2和表5)。

表5、BCL10基因在麻风病标本与正常对照标本表达量的比较(均值±标准差)

与关联分析的结果一致。证实BCL10是一种新的麻风易感基因，同时也强调了在 麻风中固有和适应性免疫应答的重要作用。

BCL10编码的蛋白属于CARD家族，在NF-KB通路中起着重要的作用，而NF-KB在 麻风杆菌的感染中起重要的作用。BCL10在淋巴样细胞L-CBM和骨髓样细胞M-CBM中 分别通过CARMA1-Bcl10-MALT1 and CARD9-Bcl10-MALT1起作用。作为内在的免疫因素， M-CBM复合体作用于NF-γB的免疫受体(ITAM)。M-CBM还可以调节MAPKs的受体(TLRs), 并通过RIP2调节NOD2通路。L-CBM参与调节适应性免疫，在NF-γB通路中起着重要 的作用，包括T细胞和B细胞信号通路。L-CBM可能涉及到B细胞中NF-γB的TLR4 调节。除了NOD2通路，本研究发现的BCL10，在麻风的发病中起着重要的作用。