法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2013-11-13
授权
授权
2013-04-03
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P21/02 申请日:20121120
实质审查的生效
2013-02-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,属于工业生物技术,发酵工程领域。
背景技术
维吉尼亚霉素(virginiamycin)又名肥大霉素、威里霉素、维及霉素,是由维吉尼亚链霉菌(Streptomyces virginiae)发酵产生的链阳性抗生素,是一类结构较为新颖的兽用抗生素,即含有内酯环的多肽类抗生素。维吉尼亚霉素在结构上由两个因子构成:M1因子(约占70-80%)和S1因子(约占20-30%)。M1因子是一种巨环内酯,分子式为C28H35N3O7,特别对金黄色细球菌有效,S1因子是一种环状多肽,分子式为C43H49N7O10,特别对藤黄八叠球菌有效。这两种因子有协同作用,当M:S=70:30时,其抗菌活性最高,合为一起可产生强大的杀菌效果,主要是对革兰氏阳性菌有显著的抑菌作用,这两种因子可以和核糖体50s亚基的23s rRNA结合,从而抑制细菌蛋白质多肽链的延伸,使蛋白合成终止导致细菌死亡。但两种因子分别单独存在时,却仅能抑菌。
维吉尼亚霉素在动物体内残留很小,有较好的生物降解性,在肠道菌群中不易产生抗性突变株。维吉尼亚霉素可以用来治疗预防猪下痢和鸡坏死性肠炎。维吉尼亚霉素在肠道中对肠道细菌做选择性杀灭,将有害及多余的肠道细菌杀死,减少乳酸、氨气、挥发性脂肪酸及有毒物质的产生,减缓肠道蠕动从而增加饲料在肠道内的停留时间,增加养分吸收,使肠壁变薄,增加肠壁渗透性,促进氨基酸和磷的吸收,提高饲料利用率,对产蛋鸡还可提高产蛋率和增加蛋黄色度。
目前,市场上维吉尼亚霉素尚无国内生产厂家,主要是从美国辉宝公司进口。
发明内容
本发明的目的是提供一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,在发酵前期加入前体物质增加维吉尼亚霉素的产量,发酵结果稳定,生产成本低,并更稳定。维吉尼亚霉素是一种含有内酯环的多肽类抗生素,具有无毒、不积累、易降解、不产生耐药性的特点,是目前一种新的兽用饲料添加剂。
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖2.0-4.0,酵母膏3.0-6.0,麦芽汁8.0-12.0,MgSO4 0.5-1.0,NaCl 0.5-1.0,K2PO4 0.5-1.0,CaCO3 2.0-4.0,琼脂15.0-30.0,水余量,培养基pH6.7-7.0,培养温度25-37℃,培养时间4-6天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉10.0-20.0,花生饼粉10.0-20.0,酵母膏3.0-5.0,可溶性淀粉 20.0-40.0,葡萄糖20.0-40.0,CaCO3 3.0-5.0,水余量,培养基pH7.0-7.2,培养温度25-37℃,培养时间24-48h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉20.0-40.0,黄豆饼粉10.0-20.0,酵母膏3.0-5.0,葡萄糖20.0-40.0,亚麻籽油5.0-10.0,K2PO4 0.5-1.0,FeSO4 0.05-0.1,(NH)2SO4 1.0-2.0,CaCO3 3.0-5.0,培养基pH7.2-7.4,培养温度25-37℃,培养时间120-144h。
其中发酵培养过程中,发酵前期12-24h加入前体物质,前体物质为乙酸钠和丙酸钠,加入量分别为0.04%和0.06%质量浓度。
ACCC40768-维吉尼链霉菌的信息来自于:http://www.mum800.com/p_91/p_6191.html。
具体信息如下:
平台资源号 1511C0001ACCC40768
菌株保藏编号 40768
中文名称 维吉尼链霉菌
属名 Streptomyces
种名加词 virginiae
其它保藏中心编号
来源历史 ←湖北省生物农药工程研究中心
收藏时间 2006-11-20
原始编号 HBERC 00177,Wa-07867
原产国 中国CN
资源归类编码 15131517101
模式菌株 非模式菌株
主要用途 研究
特征特性 在高氏一号培养基上,菌丝生长很好。基丝肉色,直径0.8μm;气丝长,灰红色,有主轴和分枝,分枝短,卷曲成孢子丝,2-3圈,孢子丝直径1.0μm孢子杆状0.8×1-1.5μm。明胶液化,牛奶不凝固,淀粉水解,产黑色素,硝酸盐还原弱,纤维素上生长。利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇。
具体用途 代谢产物具有抗菌活性。
维吉尼亚霉素是一种含有内酯环的多肽类抗生素,具有无毒、不积累、易降解、不产生耐药性的特点,是目前一种新的兽用饲料添加剂。本发明方法简单易行,工艺稳定,发酵前期加入前体物质后发酵产量高,最高发酵单位达到3500μg/ml以上,有效的解决国内没有生产的困境,得到的维吉尼亚霉素无交叉耐药性,残留少,可有效的提高饲料利用率。
具体实施方式:
实施例1:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖2.0,酵母膏3.0,麦芽汁8.0,MgSO4 0.5,NaCl 0.5,K2PO4 0.5,CaCO3 2.0,琼脂15.0,水余量,培养基pH6.7,培养温度25℃,培养时间4天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉10.0,花生饼粉10.0,酵母膏3.0,可溶性淀粉 20.0,葡萄糖20.0,CaCO3 3.0,水余量,培养基pH7.0,培养温度25℃,培养时间24h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉20.0,黄豆饼粉10.0,酵母膏3.0,葡萄糖20.0,亚麻籽油5.0,K2PO4 0.5,FeSO4 0.05,(NH)2SO4 1.0,CaCO3 3.0,培养基pH7.2,培养温度25℃,培养时间120h。
其中发酵培养过程中,发酵前期12h加入前体物质,前体物质为乙酸钠和丙酸钠,加入量分别为0.04%和0.06%质量浓度。
实施例2:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖3.0,酵母膏4.5,麦芽汁10.0,MgSO4 0.8,NaCl 0.8,K2PO4 0.8,CaCO3 3.0,琼脂23.0,水余量,培养基pH6.8,培养温度31℃,培养时间5天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉15.0,花生饼粉15.0,酵母膏4.0,可溶性淀粉 30.0,葡萄糖30.0,CaCO3 4.0,水余量,培养基pH7.1,培养温度31℃,培养时间36h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉30.0,黄豆饼粉15.0,酵母膏4.0,葡萄糖30.0,亚麻籽油8.0,K2PO4 0.8,FeSO4 0.08,(NH)2SO4 1.5,CaCO3 4.0,培养基pH7.3,培养温度31℃,培养时间132h。
其中发酵培养过程中,发酵前期18h加入前体物质,前体物质为乙酸钠和丙酸钠,加入量分别为0.04%和0.06%质量浓度。
实施例3:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖4.0,酵母膏6.0,麦芽汁12.0,MgSO4 1.0,NaCl1.0,K2PO4 1.0,CaCO3 4.0,琼脂30.0,水余量,培养基pH7.0,培养温度37℃,培养时间6天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉20.0,花生饼粉20.0,酵母膏5.0,可溶性淀粉40.0,葡萄糖40.0,CaCO3 5.0,水余量,培养基pH7.2,培养温度37℃,培养时间48h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉40.0,黄豆饼粉20.0,酵母膏5.0,葡萄糖40.0,亚麻籽油10.0,K2PO4 1.0,FeSO4 0.1,(NH)2SO4 2.0,CaCO3 5.0,培养基pH7.4,培养温度37℃,培养时间144h。
其中发酵培养过程中,发酵前期24h加入前体物质,前体物质为乙酸钠和丙酸钠,加入量分别为0.04%和0.06%质量浓度。
实施例4:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖1.5,酵母膏7.0,麦芽汁7.0,MgSO4 0.3,NaCl2.0,K2PO4 0.4,CaCO3 5.0,琼脂13.0,水余量,培养基pH7.2,培养温度22℃,培养时间7天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉25.0,花生饼粉8.0,酵母膏6.0,可溶性淀粉 45.0,葡萄糖18.0,CaCO3 6.0,水余量,培养基pH6.8,培养温度40℃,培养时间20h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉45.0,黄豆饼粉25.0,酵母膏2.0,葡萄糖18.0,亚麻籽油12.0,K2PO4 1.2,FeSO4 0.2,(NH)2SO4 2.5,CaCO3 6.0,培养基pH7.0,培养温度20℃,培养时间150h。
其中发酵培养过程中,发酵前期26h加入前体物质,前体物质为乙酸钠和丙酸钠,加入量分别为0.04%和0.06%质量浓度。
实施例5:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖2.5,酵母膏4.0,麦芽汁8.0,MgSO4 0.6,NaCl1.0,K2PO4 0.7,CaCO3 2.0,琼脂20.0,水余量,培养基pH6.7,培养温度30℃,培养时间4天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉16.0,花生饼粉20.0,酵母膏4.5,可溶性淀粉 28.0,葡萄糖35.0,CaCO3 3.8,水余量,培养基pH7.0,培养温度37℃,培养时间30h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉20.0,黄豆饼粉18.0,酵母膏3.0,葡萄糖30.0,亚麻籽油8.0,K2PO4 0.5,FeSO4 0.06,(NH)2SO4 1.3,CaCO3 5.0,培养基pH7.2,培养温度35℃,培养时间130h。
实施例6:
一种链霉菌生物合成维吉尼亚霉素的方法,是通过以下措施实现的:
(1)斜面培养:将在北京北纳创联生物技术研究院购买的ACCC40768-维吉尼链霉菌,菌株保藏编号为40768,接种到营养培养基上,进行斜面培养;
(2)种子培养:斜面培养得到的孢子进行种子培养,得到种子液;
(3)发酵培养:将种子液接种到发酵培养基中进行培养,并在发酵前期加入前体物质,得到发酵液,分离后得到含有内酯环的多肽类抗生素维吉尼亚霉素。
其中斜面营养培养基各成分的浓度为g/L:葡萄糖3.0,酵母膏5.0,麦芽汁12.0,MgSO4 0.9,NaCl1.0,K2PO4 0.7,CaCO3 2.5,琼脂15.0,水余量,培养基pH7.0,培养温度28℃,培养时间4天。
其中种子培养基各成分的浓度为g/L:黄豆饼粉18.0,花生饼粉20.0,酵母膏4.5,可溶性淀粉 27.0,葡萄糖40.0,CaCO3 3.0,水余量,培养基pH7.2,培养温度32℃,培养时间40h。
其中发酵培养基各成分的浓度为g/L:可溶性淀粉32.0,黄豆饼粉16.0,酵母膏5.0,葡萄糖36.0,亚麻籽油6.0,K2PO4 0.5,FeSO4 0.08,(NH)2SO4 1.7,CaCO3 5.0,培养基pH7.4,培养温度34℃,培养时间135h。
其中发酵培养过程中,发酵前期18h加入前体物质,前体物质为乙酸钠,加入量分别为0.1%质量浓度。
实施例7:
ACCC40768-维吉尼链霉菌的信息来自于:http://www.mum800.com/p_91/p_6191.html。
具体信息如下:
平台资源号 1511C0001ACCC40768
菌株保藏编号 40768
中文名称 维吉尼链霉菌
属名 Streptomyces
种名加词 virginiae
其它保藏中心编号
来源历史 ←湖北省生物农药工程研究中心
收藏时间 2006-11-20
原始编号 HBERC 00177,Wa-07867
原产国 中国CN
资源归类编码 15131517101
模式菌株 非模式菌株
主要用途 研究
特征特性 在高氏一号培养基上,菌丝生长很好。基丝肉色,直径0.8μm;气丝长,灰红色,有主轴和分枝,分枝短,卷曲成孢子丝,2-3圈,孢子丝直径1.0μm孢子杆状0.8×1-1.5μm。明胶液化,牛奶不凝固,淀粉水解,产黑色素,硝酸盐还原弱,纤维素上生长。利用D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-果糖、蔗糖、棉子糖、鼠李糖、肌醇、D-甘露醇。
具体用途 代谢产物具有抗菌活性。
各个实施例1-6得到的发酵液用HPLC进行检测,检测条件如下:
色谱柱:5 μm, 250×4.6 mm Ultrashere ODS;
进样量:20 ul;
流动相:乙腈:纯水(用1ml85%的磷酸调节pH值)=40:60;
检测波长:210 nm;
温度:35℃;
流速:1 ml/min;
保留时间:组分M1(4min),组分S1(11.6min)。
标准溶液的配制:维吉尼亚霉素标准品含有57.2%的M1和19.2%的S1,生物活性为222%,精密称取45mg维吉尼亚霉素标准品,置100ml容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀。
样品的处理:量取5ml发酵液置于100ml容量瓶中,用样品提取溶剂定容,超声处理30分钟,冷却,用流动相稀释至刻度,摇匀,过滤进样。样品提取溶剂是丙酮和柠檬酸按一定比例配制成的(柠檬酸用纯水配成0.5mol/L),将四份丙酮和一份柠檬酸混合,再加入2%(m/v)的硫代乙酰胺。
各实施例制得的维吉尼亚霉素的生物效价如下表所示:
从此表的结果可以看出,本发明制得的维吉尼亚霉素的效价达到了3500μg/ml以上,且30天后效价也维持在较高水平,尤其以实施例2的效果最好,明显优于在本发明工艺范围外的实施例4、不加前体物质的实施例5和加一种前体物质的实施例6,因此本发明采用的工艺参数和前体物质联用的制备方法大大提高了维吉尼亚霉素的产量,并更稳定,有效的解决国内没有生产的困境。
机译: 产链霉菌转化的α-葡萄糖苷酶抑制剂的链霉菌有效链霉素生物合成基因簇制备物的核苷酸序列和这些抑制剂的批量生产方法
机译: 编码DNA的重组DNA矢量,该矢量衍生自一种由羧苄青霉素生物合成基因(指定护理)衍生的4“ -0-异戊酸羧化酶,用于链霉菌及其他生物
机译: 线虫霉素生物合成水平提高的线型链霉菌菌株的获得方法