抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体

摘要

本发明涉及生物技术领域，公开了抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。本发明所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞保藏编号为CCTCC NO：C201221。本发明所述杂交瘤细胞能够稳定产生抗GLIPR-2单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。 

背景技术

GLIPR-2（glioma pathogenesis related-2，GLIPR-2）属于PR-1（pathogenesis related-1）家族，普遍表达于哺乳动物外周血单核细胞和脾脏。最近的研究发现，肾脏纤维化中GLIPR-2表达基因在肾小管上皮细胞中表达增加，提示它在这一病理过程中具有重要作用。 

肾脏纤维化是一种病理生理改变，是肾脏的功能由健康到损伤，再到损坏，直至功能丧失的渐进过程，主要包括肾间质纤维化与肾小球硬化。以往认为肾功能减退是由于肾小球病变所致，然而自1970年Schainuch提出肾小管间质（Tubuleinterstitium，TI）损害与肾功能减退呈显著相关的观点以来，TI损害日益得到重视。 

研究发现，表达GLIPR-2的肾小管上皮细胞明显向间质细胞转化，是肾脏成纤维细胞的主要来源之一。但目前对于GLIPR-2在纤维化中作用的分子机制尚不清楚，主要原因是缺乏有效的试验工具，特别是抗GLIPR-2的特异性抗体。因此，提供一种抗GLIPR-2的单克隆抗体，对进一步研究GLIPR-2的分子作用机制具有重要意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体。 

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案： 

抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏编号为CCTCC NO：C201221。 

本发明所述抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞由以下方法制备获 得： 

GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠，然后取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性杂交瘤细胞用有限稀释法克隆至能稳定分泌抗GLIPR-2单克隆抗体，即获得抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞。 

其中，所述GLIPR-2蛋白免疫BALB/C小鼠优选为： 

取GLIPR-2蛋白100μg加等质量福氏完全佐剂对BALB/C小鼠进行第一次免疫注射，3周后取GLIPR-2蛋白300μg加等质量福氏不完全佐剂对BALB/C小鼠进行第二次免疫注射，7周后取GLIPR-2蛋白500μg对BALB/C小鼠进行第三次免疫注射。本发明免疫所用GLIPR-2蛋白可参照文献《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达》（黄绍光，李强，钮芹，倪丹妮，蒲晓允，免疫学杂质，2010年5月第26卷第5期）记载的内容获得。 

所述HAT培养具体操作优选为： 

用含20%胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2周。 

所述ELISA检测具体操作优选为： 

杂交瘤细胞培养上清液加入到GLIPR-2蛋白包被的酶标板中于37℃孵育20min，洗涤后以工作浓度为1:2000的标准加HRP标记的羊抗鼠IgG于37℃孵育20min，然后加邻苯二胺底物显色15min后终止反应。 

经过上述方法制备后，最终筛选出能够稳定分泌抗GLIPR-2单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为1A11A11C9E2，并于2012年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学。 

此外，本发明还提供一种抗GLIPR-2单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC NO：C201221的杂交瘤细胞分泌产生。 

制备抗GLIPR-2单克隆抗体可采用本技术领域常规方法，如用杂交瘤细胞株诱导小鼠腹水，本发明优选为： 

将保藏编号为CCTCC NO：C201221的杂交瘤细胞传代培养，取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5×10⁵个/只，诱导腹水，离心，收集上清，用DEAE-SephadexA50离子交换柱层析法纯化抗GLIPR-2单克隆抗体。 

本发明所述保藏编号为CCTCC NO：C201221的杂交瘤细胞染色体稳定，其分泌产生的抗GLIPR-2单克隆抗体均为IgG1型，效价较高，直接培养的上清可达1：2000，小鼠腹水可达10mg/mL，效价可达1：10000，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。因此，本发明还提供了保藏编号为CCTCC NO：C201221的杂交瘤细胞在制备抗GLIPR-2单克隆抗体中的应用。 

由以上技术方案可知，本发明提供了一株抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其分泌产生的抗GLIPR-2单克隆抗体，该杂交瘤细胞能够稳定产生抗GLIPR-2单克隆抗体，且细胞染色体稳定、抗体效价高，完全能够应用于GLIPR-2的分子作用机制的研究中。 

生物保藏信息说明 

杂交瘤细胞株1A11A11C9E2于2012年7月5日保藏在保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C201221。 

具体实施方式：

本发明公开了抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生的抗GLIPR-2单克隆抗体，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。 

下面就本发明提供的抗GLIPR-2单克隆抗体杂交瘤细胞及其产生 的抗GLIPR-2单克隆抗体做进一步说明。 

实施例1：免疫小鼠 

1、材料 

抗原：GLIPR-2蛋白，根据文献《人GLIPR-2基因的克隆及在原核中可溶性表达》（黄绍光，李强，钮芹，倪丹妮，蒲晓允，免疫学杂质，2010年5月第26卷第5期）的方法制备； 

试验动物：6周龄、17g左右BALB/C小鼠（由第三军医大学实验动物中心提供）； 

试剂：福氏完全佐剂和不完全佐剂（购自Promega公司）； 

2、方法 

BALB/C小鼠后腿肌肉及背部皮内注射抗原免疫，第一次100μg加等量福氏完全佐剂，3周后用100μg加等量福氏不完全佐剂，7周后500μg不加佐剂腹腔注射，腹腔注射后第4天准备进行细胞融合。 

实施例2：细胞融合 

1、材料 

骨髓瘤细胞：SP2/0细胞（由中国典型培养物保藏中心提供）； 

培养基：胎牛血清（购自Invitrogen公司）；HAT选择性培养基（购自Sigma公司）； 

饲养细胞： 

2、方法 

腹腔注射后第4天取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0细胞在50%聚乙二醇作用下融合。融合后的杂交瘤细胞用含20%进口胎牛血清的HAT选择性培养基混均加入种有饲养细胞的96孔板中培养，2周后在倒置显微镜下挑选克隆孔。 

接种96孔细胞培养板7块共660孔（对照孔除外），其中420孔有克隆生长，融合率为64%（420/660）。 

实施例3：ELISA检测 

GLIPR-2蛋白包被酶标板，封闭后加杂交瘤细胞培养上清液37℃孵育20min，洗涤后加HRP标记的羊抗鼠IgG（工作浓度1∶2000），37℃孵育20min后洗涤，加邻苯二胺（OPD）底物显色15min后终止反应。同时设阴性、阳性和空白对照，筛选出能分泌抗体的杂交瘤细胞。结果显示，抗体阳性有16孔，阳性率为2.4%（16/660)。 

实施例3：克隆化培养及染色体鉴定 

将前述筛选出的阳性杂交瘤细胞用有限稀释法进行多次克隆化培养，至克隆细胞抗体阳性率为100%，获得10株能稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞，选择其中一株活性最强的杂交瘤细胞，命名为1A11A11C9E2。 

秋水仙素处理传代培养的1A11A11C9E2杂交瘤细胞，0.075mol/LKCl溶液低渗处定、铺片，10%Giemsa染色，镜检。结果显示，正常BALB/C小鼠脾细胞染色体的数目恒定为40对，同品系的SP2/0细胞的染色体众数目为68对，1A11A11C9E2杂交瘤细胞的染色体数目约为两种亲本染色体数目的总合，染色后计数为102对。 

实施例4：腹水诱导抗GLIPR-2单克隆抗体及抗体亚型检测 

1A11A11C9E2杂交瘤细胞经传代取对数生长期的细胞计数，小鼠腹腔接种5×10⁵个/只，诱导腹水,离心，收集上清，用DEAE-SephadexA50离子交换柱层析法纯化单克隆抗体。 

用鼠源性单克隆抗体亚型检测试剂盒（购自于Sigma）鉴定，结果显示，制备的单克隆抗体均为IgG1型。 

实施例5：抗GLIPR-2单克隆抗体特异性及效价检测 

1、特异性检测 

采用常规的Western Blot印迹测定抗体纯度，操作步骤参见《分子生物学基本实验技术》（赵亚力，马学斌，韩为东主编），一抗为本发 明腹水纯化后的抗GLIPR-2单克隆抗体，二抗为羊抗鼠IgG/HRP，ECL试剂盒。 

结果显示，抗GLIPR-2单克隆抗体可特异性识别分子量为17KD的抗GLIPR-2蛋白。 

2、ELISA法效价检测 

按照常规ELISA法进行检测，结果显示，直接培养的上清可达1：2000，小鼠腹水可达10mg/mL，效价可达1：10000。 

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。