一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物

摘要

本发明公开了一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，为RSPO2基因。本发明还公开了一种RSPO2基因甲基化的MSP检测方法，包括以下步骤：提取包含RSPO2基因的基因组DNA，检测其纯度与含量；用亚硫酸氢钠进行处理修饰；以步骤处理修饰后的DNA为模板，设计RSPO2甲基化特异性引物，进行PCR扩增，结束后，取PCR产物电泳检测；分析结果，对RSPO2甲基化的特异性引物扩增出139bp条带的PCR产物为甲基化阳性，即存在RSPO2甲基化。本发明利用RSPO2作为结直肠癌大量筛查的生物标记物，并且提供了RSPO2甲基化状态检测方法，可检测患者是否患有结直肠癌，具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种结直肠癌筛查的技术领域，具体涉及一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，即通过对DNA样品中该生物标记物的甲基化状态进行检测以确定罹患结直肠癌的可能性。

背景技术

结直肠癌是世界最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居恶性肿瘤的第三位，且呈上升趋势。北美和西欧国家结直肠癌发病率分别达44.4/10万和42.9/10万，我国也已达13.29/10万。结直肠癌一般会经历7～10年的从正常粘膜组织、腺瘤、再到恶性肿瘤的演变过程。结直肠癌的早期治愈率可达90%，但晚期治愈率仅为5%。因此，早期筛查和手术切除腺瘤或早期恶性肿瘤对降低结直肠癌的死亡率意义重大。

结直肠癌传统的筛查方法包括粪便潜血试验、粪便免疫试验、结肠钡剂灌肠检查、乙状结肠镜检查及结肠镜检查。其中，粪便潜血试验和粪便免疫试验具有一定的特异性和灵敏性，但前提是患者已存在明显的肿瘤大小，因此不适用于结直肠癌的早期检测。内窥镜检查是目前结直肠癌筛查的最好方法，但由于这种方法侵入性、费用高、风险大、易产生并发症等缺陷限制了其在普查筛选中的应用。因此需要寻找一种方便、经济、无创，且具有较高检出率的方法用于结直肠癌的大规模筛查。

最近研究发现DNA甲基化状态改变与癌症的发生发展关系密切。DNA甲基化主要出现在基因启动子区域的CpG岛中的胞嘧啶，通过阻碍转录因子的结合从而导致基因表达沉默。已经发现在许多癌症中都存在抑癌基因、DNA修复基因、细胞周期调节基因的高甲基化。因此肿瘤相关基因的甲基化是癌症的重要指标，可作为结直肠癌的早期检测与诊断的生物标记物。

随着对结直肠癌研究的深入，发现许多抑癌基因、致癌基因和细胞信号转导通路参与了肠上皮细胞的癌转化以及肿瘤发展，其中Wnt信号通路的调控作用尤为重要。Wnt的途径激活涉及Wnt蛋白与细胞表面受体Frizzled和联合受体LRP5/6的结合，并导致APC/Axin/CK1a/GSK3β复合物解体，促进β-catenin入核，从而激活下游靶基因表达。研究发现，Wnt信号通路的异常激活在结直肠癌发生发展中起重要作用。Wnt信号通路的两个重要成员APC或β-catenin在80～90%的结直肠癌患中发生了突变。

结直肠癌中Wnt信号通路可受多种机制调控，如通路成员的突变、表观遗传沉默基因表达、配体激活和拮抗基因的抑制等。目前发现多种能调控Wnt信号通路的蛋白，包括SFRP蛋白家族、WIF1、Wise和DKK蛋白家族等。R-spondin (RSPO)是近年来发现能够调控Wnt信号通路的一个新蛋白家族。RSPO家族由4个富含半胱氨酸的分泌蛋白组成，即RSPO1、RSPO2、RSPO3和RSPO4。RSPO家族蛋白参与了多种生物学进程，如细胞增殖，胚胎发育，骨骼形成，肌肉细胞分化，肿瘤的发生等。

R-spondin2 (RSPO2)是RSPO家庭成员之一，其具有多种生物学功能。RSPO2基因位点与人类Dupuytren疾病的遗传易感性相关。RSPO2通过调节Wnt信号通路影响狗毛的样式。RSPO2同时是脊椎动物胚胎发育的关键基因，RSPO2基因敲除小鼠在出生后立即死亡，并携带多种生理缺陷，如肢体发育不全，颅面和喉气管畸形，肺发育不良。最近研究发现RSPO2与癌症的发生相关。一项研究表明，RSPO2可以影响乳腺上皮细胞的生长和促进肿瘤转移。在结直肠癌中，FOXQ1基因的过表达显著改变RSPO2的表达。已经发现RSPO2的mRNA和蛋白表达在结直肠癌细胞及组织中明显下调。进一步研究发现，肠癌细胞的RSPO2甲基化水平显著高于对照细胞。对临床样品检测也发现RSOP2的甲基化程度与结直肠癌高度相关。因此，RSPO2甲基化可作为结直肠癌早期检测或筛查的有用标记。

目前，现有技术虽然存在对DNA基因甲基化的检测方法但并没有具体对RSPO2基因进行甲基化的检测方法进行研究。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，可以通过该生物标记物筛查人类患结直肠癌的可能性；本发明的另一目的在于：提供了一种RSPO2基因甲基化的MSP检测方法，实现了RSPO2基因的甲基化检测。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种用于结直肠癌大量筛查的生物标记物，所述的生物标记物为RSPO2基因。

作为优选，用MSP检测结直肠癌细胞中RSPO2甲基化状态时使用的引物对为对RSPO2甲基化状态有特异性的上游引物RSPO2-M1和下游引物RSPO2-M2，引物对的序列如下：

引物名称引物序列RSPO2-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSPO2-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC

作为优选，所述的包含RSPO2基因的基因组DNA来源于结直肠癌细胞。

本发明中的RSPO2基因甲基化状态与结直肠癌相关，利用RSPO2基因作为结直肠癌大量筛查的生物标记物，可以为人们早期筛查结直肠癌作出贡献。

为了实现本发明的另一目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种RSPO2基因甲基化的MSP检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）提取包含RSPO2基因的基因组DNA，用分光光度计检测DNA纯度与含量；

（2）对提取的包含RSPO2基因的基因组DNA用亚硫酸氢钠进行处理修饰；

（3）以步骤（2）中处理修饰后的DNA为模板，设计RSPO2甲基化特异性引物，取RSPO2甲基化特异性引物、DNA聚合酶、PCR反应缓存液、dNTP、去离子水混合，进行PCR扩增，

PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、退火45 s、72℃ 40 s共37个循环，72℃延伸10 min；

（4）PCR反应结束后，取PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测；

（5）对检测结果进行分析，对RSPO2甲基化的特异性引物扩增出139 bp条带的PCR产物为甲基化阳性，即存在RSPO2甲基化。

作为优选，所述的步骤（3）中的RSPO2甲基化特异性引物对的序列如下：

引物名称引物序列RSPO2-M1TTGTATTTTTATCGGAAAGTGCRSPO2-M2ATATCGCTTCCTACGCTTTC

作为优选，所述的包含RSPO2基因的基因组DNA来源于粪便。

本发明的RSPO2基因甲基化的MSP检测方法检测快速、灵敏，处理更为快捷，能够方便地检测RSPO2基因的甲基化状态。

RSPO2基因甲基化状态与结直肠癌相关，RSPO2可作为结直肠癌筛查的生物标记物，即可通过检测病人的RSPO2基因甲基化状态来确定病人罹患结直肠癌的可能性。本发明方法可以利用人类粪便作为检测样品。粪便样本含有脱落的正常结直肠上皮细胞和游离的DNA，也含有大量从结直肠癌上脱落的癌细胞和游离的癌DNA，同时肠道是碱性环境，有利于DNA的保存，从而可从粪便中提取出质量较好的DNA，因此，粪便DNA是用于结直肠癌检测的最佳标本。

应用MSP检测结直肠癌细胞中RSPO2甲基化状态的方法来检测患者是否患有结直肠癌，具有非侵入性、样品收集方便灵活等特点，此外，只需要采用常规仪器和试剂即可，成本较低，可适用于日益增长的结直肠癌的大规模筛查。

附图说明

图1为本发明实施例1结直肠癌中RSPO2表达下调水平状态图，其中，图A为RSPO2在各细胞系中的mRNA水平，图B为RSPO2在结直肠癌组织中的mRNA水平显示图；

图2 为本发明实施例2中5-氮-2’-脱氧胞苷处理后结直肠癌细胞中RSPO2表达水平上调图；

图3 为本发明实施例2中结直肠癌细胞中RSPO2甲基化状态，其中，图A为RSPO2基因的CpG岛示意图，图B为利用MSP检测结直肠癌细胞中RSPO2甲基化状态，图C为BSP检测结直肠癌细胞中RSPO2的甲基化状态图；

图4 为本发明实施例3中利用MSP检测结直肠癌组织中RSPO2甲基化状态图；

图5为本发明实施例4中利用MSP检测结直肠癌患者粪便中RSPO2甲基化状态图；

图6为本发明实施例4中利用MSP检测结直肠癌患者和正常人粪便中RSPO2甲基化状态图。

具体实施方式

实施例1

结直肠癌中RSPO2的表达下调

利用Trizol法提取细胞总RNA并经Invitrogen公司的MLV-reverse transcriptase试剂盒反转录为cDNA，操作均按试剂盒推荐方法进行。根据人RSPO2核苷酸序列设计用于荧光定量PCR的引物RSPO2-F和RSPO2-R，引物序列如下：

引物RSPO2-F：5’-ACAATACTGTGTCCAACCAT-3’；

引物RSPO2-R：5’-TCCTCTTCTCCTTCGCCTTT-3’；

以GADPH为内参，其扩增引物为：

GADPH-F：5’- ACGGATTTGGTCGTATTGGGC -3’；

GADPH-R：5’- CTCGCTCCTGGAAGATGGTGAT -3’。

以cDNA为模板，应用TIANGEN公司的RealMssterMix试剂盒进行实时荧光定量PCR反应，操作参照试剂盒推荐方法进行。

具体地，PCR反应体系为20 μl，其中包括2.5×RealMasterMix / 20×SYBR solution 9 μl，1 μM的上下游引物各0.5 μl，cDNA 9 μl，去离子水1 μl。PCR反应条件为：95℃预变性2 min，95℃ 15s、60℃ 30s、68℃ 30 s，共40个循环，最后95℃ 15 s、60℃ 1 min、95℃ 15 s、60℃ 15 s进行熔解曲线的扩增。将目的基因与GAPDH的比值作为其mRNA水平的相对值。实验重复3次。

实验结果采用2^-△△Ct相对定量分析法，并以GAPDH基因作为内参基因来计算转录的相对差异。具体计算公式为：

①   计算△Ct值：△Ct=Ct(RSPO2)-Ct(GAPDH)；

②   计算△△Ct值：△△Ct=△Ct（样品）-△Ct（对照）；

③   计算相对差值2^-△△Ct，即经过处理后RSPO2相对于对照组在mRNA水平上的表达差异。

使用实时荧光定量PCR法检测了9种肠癌细胞系：Colo205、HT29、LOVO、HCT116、Caco2、LS174T、RKO、SW480、DLD1中RSPO2 的mRNA表达水平，结果显示这9种肠癌细胞中RSPO2的mRNA水平均低于正常肠粘膜对照组织的水平，其中有7种细胞LOVO、HCT116、Caco2、LS174T、RKO、SW480、DLD1中的RSPO2的 mRNA表达不及对照的10%如图1A所示，Normal mucosa为10个肠粘膜组织的混合样本，其RSPO2相对表达量设定为100%。基于RSPO2在肿瘤细胞系中的下调现象，我们选取50对肠癌组织样本，并利用实时荧光定量PCR分析其RSPO2 mRNA表达情况。发现44个即88%的肠癌组织中RSPO2的mRNA水平相比其各自的癌旁组织都明显下调，只有2个样本中的表达出现上调，如图1B所示，T：肠癌组织；N：癌旁组织；纵坐标表示为：log2(T/N)= -△△Ct = -（△Ct肠癌组织-△Ct癌旁组织）。

实施例2

鉴别RSPO2甲基化为潜在的结直肠癌生物标记物

（1）5-氮-2’-脱氧胞苷处理后肠癌细胞RSPO2表达水平上调

RSPO2在肠癌细胞中的低表达可能由于表观遗传异常造成。为了区分是由于基因甲基化还是由于组蛋白修饰造成的，我们分别用DNA甲基化转移酶抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷和组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A处理肠癌细胞并随后对细胞中RSPO2 mRNA表达进行了检测。

具体地，1×10⁵细胞/孔接种于6孔板，培养24 h。按以下分组进行实验：

对照组为同期不加药的细胞；

实验组：

①5-Aza-dC组：2 μM 5-Aza-dC处理96 h，

②TSA组：0.3 μM TSA处理24 h，

③联合组：2 μM 5-Aza-dC处理72 h后再用0.3μM TSA继续处理24 h。5-Aza-dC处理的实验组每隔24 h更换一次培养基。

实验结果显示5-Aza-dC处理后，HCT116和DLD1中RSOP2 mRNA表达水平明显上调，而TSA处理后RSOP2 mRNA表达水平则无明显变化如图2所示，其中，DMSO为二甲基亚砜；5-Aza-dC为5-氮-2’-脱氧胞苷，TSA为曲古抑菌素A；纵坐标表示为：2-ΔΔCt，其中-ΔΔCt = -（ΔCt处理组-ΔCt对照组），说明甲基化修饰是RSPO2表达下调的主要原因。

（2）结直肠癌细胞中RSPO2甲基化明显高于正常细胞

应用MSP和BSP检测直肠癌细胞中RSPO2基因甲基化的状态，具体操作按以下方法进行。

结直肠癌细胞的基因组DNA提取使用Bioteke公司的基因组DNA提取试剂盒，操作参照试剂盒进行。具体地，离心收集细胞，用200 μl缓冲液TB洗涤细胞一次，细胞重悬于200 μl缓冲液TB中。随后加入200 μl结合液CB，剧烈颠倒充分混匀后加入20 μl浓度为20 mg/ml蛋白酶K溶液，充分混匀后70℃放置10 min。冷却后加入100 μl异丙醇，颠倒充分混匀，出现絮状沉淀。将上述溶液和絮状沉淀加入一个吸附柱AC中，10000 rpm离心30 s，弃废液。分别用500 μl抑制物去除液IR、700 μl漂洗液WB和500 μl漂洗液WB洗涤柱子，最后加入100 μl洗脱缓冲液EB洗脱收集基因组DNA。

基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰使用Zymo Research公司的EZ DNA methylation-gold kit，操作参照试剂盒推荐方法进行。具体地，将20 μl DNA加入130 μl CT转换试剂，混匀，于98℃ 孵育10 min，64℃孵育2.5 h，4℃保存不超过20 h。将柱子置于收集管中，向柱中加入600 μl M-Binding Buffer，接着加入上述DNA混合液于柱子中，上下颠倒混匀，离心，弃废液。用1100 μl M-wash Buffer 洗涤柱子后加入200 μl M-Desulphonation Buffer，室温包被15-20 min，离心，弃废液。用200 μl M-wash Buffer洗涤柱子2次后，加入10 μl的M-Elution Buffer洗脱收集DNA。

MSP即甲基化特异性PCR反应法检测结直肠癌细胞中RSPO2基因甲基化的状态：

利用Methyl Primer Express v1.0软件分析目的基因的CpG岛并设计甲基化和非甲基化特异性引物。以修饰后的DNA为模板，利用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增，甲基化特异性PCR反应引物对如下：

上游引物RSPO2-M1：5’-TTGTATTTTTATCGGAAAGTGC-3’，

下游引物RSPO2-M2：5’-ATATCGCTTCCTACGCTTTC-3’，

扩增片段大小为139 bp。非甲基化特异性PCR反应引物对为：

上游引物RSPO2-U1：5’-GGTTTGTATTTTTATTGGAAAGTGT-3’，

下游引物RSPO2-U2：5’-ATATCACTTCCTACACTTTCTCC-3’，

扩增片段大小为139 bp。反应体系为20 μl，其中含有10×PCR buffer 2 μl，Taq酶0.5 μl，10 mM 的dNTP 2 μl，DNA 60 ng，10 μM的引物各1 μl，灭菌去离子水补齐至20 μl。PCR反应条件为：94℃预变性3 min, 94℃ 30 s、退火45 s、72℃ 40 s共37 个循环，72℃ 延伸10 min。每次PCR均以等量去离子水做空白对照。取10 μl PCR产物，以DL2000为标准分子量，用2%琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。

结果判定标准：①甲基化引物扩增阳性，非甲基化引物扩增阴性，即为完全甲基化；甲基化引物和非甲基化引物扩增均出现阳性条带视为部分甲基化，仍记为甲基化阳性；②甲基化引物扩增阴性，非甲基化引物扩增阳性，为甲基化阴性。

BSP即硫化测序PCR反应检测肠癌细胞中RSPO2基因甲基化的状态：

利用Methyl Primer Express v1.0软件分析目的基因的CpG岛并设计BSP特异性引物：

RSPO2-B1：5’-TTTTGAGGATGAATAAAAGTTG-3’，

RSPO2-B2：5’-CTCCCTAAACACAATACTC-3’，

以修饰后的DNA为模板，利用特异性引物进行PCR扩增。反应体系为20 μl，其中含有2×GC buffer 10 μl，Taq酶 0.5 μl，10 μM的dNTP 2 μl，DNA 50 ng，10 μM的引物各1 μl，灭菌去离子水补齐至20 μl。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、退火45 s、72℃ 30 s共37 个循环，72℃ 延伸10 min。使用TaKaRa的DNA片段回收试剂盒和大连宝生物公司的pMD18-T载体试剂盒分别对PCR产物进行纯化回收和克隆。重组质粒由上海英潍捷基贸易有限公司测序。测序结果经Quantification tool for methylation analysis software在线分析RSPO2甲基化情况。

对RSPO2基因结构分析发现，于RSPO2基因启动子及外显子1区域间有一个CpG岛，如图3A所示，甲基化特异性PCR引物用箭头表示；硫化测序PCR扩增片段如图所示。利用MSP方法检测9种肠癌细胞系中RSPO2基因甲基化状态，结果显示9种肠癌细胞系中RSPO2基因均发生100%甲基化，而对照细胞HEK293中RSPO2基因无甲基化修饰如图3B所示，其中，U为非甲基化特异性扩增；M为甲基化特异性扩增。

为了进一步检测肠癌细胞中RSPO2基因甲基化程度，我们利用BSP对3种肠癌细胞HCT116、DLD1、174T，及对照细胞HEK293进行了检测。我们检测了每个细胞系的10个PCR扩增克隆，以确定每一个CpG位点的甲基化状态。结果显示，在3种肠癌细胞，每个克隆有75-97%的位点发生甲基化，如图3C所示，黑点表示发生甲基化的位点；白圈表示未被甲基化的位点。而对照细胞中，只有2-6%的位点发生甲基化。上述结果表明，RSPO2基因可作为检测结直肠癌的潜在生物标记物，利用MSP检测RSPO2基因状态可用于确定病人患有结直肠癌的可能性。

实施例3

应用MSP检测结直肠癌组织中RSPO2甲基化状态

基因组DNA提取及亚硫酸氢钠修饰同实施例2所述。使用MSP方法检测结直肠癌组织和正常肠粘膜组织中RSPO2甲基化的状态。具体地，以修饰后的DNA为模板，利用甲基化引物，RSPO2-M1和RSPO2-M2，和非甲基化特异性引物，RSPO2-U1和RSPO2-U2，进行PCR扩增，扩增片段大小均为139 bp。

PCR反应体系为20 μl：10×PCR buffer 2 μl，Taq酶 0.5 μl，10 mM 的dNTP 2 μl，DNA 60 ng，10 mM 的引物各1 μl，ddH₂O加至20 μl。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、退火45 s、72℃ 40 s共37个循环，72℃ 延伸10 min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

利用MSP方法，分别以RSPO2甲基化引物和非甲基化引物进行扩增。其中，以甲基化引物扩增出139 bp条带者为甲基化阳性。结果显示，RSPO2甲基化高比率出现在结直肠癌组织中如图4所示，P1-10为组织样品1-10，T为肠癌组织，N为癌旁组织，U为非甲基化特异性扩增，M为甲基化特异性扩增，说明利用MSP方法检测RSPO2基因的甲基化状态可用于结直肠癌的筛查。

实施例4

应用MSP检测结直肠癌患者粪便中RSPO2甲基化状态

收集粪便样品并提取样品基因组DNA，具体方法如下：

粪便样品收集后于72 h内冻存于-80℃，粪便样品于室温解冻后加入7倍体积的EXACT Science公司的 EXACT buffer A进行匀浆。匀浆样品可于-80℃保存6-18个月。为了避免DNA样品的降解，匀浆样品只解冻一次。取含4 g粪便的匀浆，离心收集上清。于上清中加入20 μl浓度为2.5 mg/ml的RNase A，37℃孵育1 h。加入1/10体积3 M NaAc和等体积异丙醇沉淀DNA，随后加入4 ml 1×TE缓冲液重悬DNA。最后用分光光度计检测DNA纯度与含量。基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰同实施例2所述。

应用MSP方法检测粪便样品中RSPO2甲基化状态：以修饰后的粪便基因组DNA为模板，分别利用甲基化引物RSPO2-M1和RSPO2-M2，以及非甲基化特异性引物RSPO2-U1和RSPO2-U2进行PCR扩增，扩增片段大小均为139 bp。

PCR反应体系为20 μl：10×PCR buffer 2 μl，Taq酶0.5 μl，10 mM 的dNTP 2 μl，DNA 60 ng，10 μM的引物 各1 μl，ddH₂O加至20 μl。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃ 30 s、退火45 s、72℃ 40 s共37个循环，随后72℃延伸10 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析。

对实施例3中结直肠癌组织样品患者的粪便样品进行RSPO2甲基化检测。结果发现50个样品中有27个为甲基化阳性，检测率为54%，如图5所示，其中T1-12为结直肠癌患者粪便样品1-12，U为非甲基化特异性扩增，M为甲基化特异性扩增。

随后我们将检测范围扩大。收集200位结直肠癌患者和200位正常人的粪便样品并随机编号，然后使用甲基化特异性引物对这400个样品进行MSP检测。结果显示，400个样品中有124个为阳性。随后复查发现其中103个属于结直肠癌患者，检出率为51%；而余下的21个属于正常人，即假阳性率约为10%，如图6所示。N1-40为正常人粪便样品1-40，T1-40为结直肠癌患者粪便样品1-40，图上所示均为甲基化特异性扩增结果。上述结果说明应用MSP方法检测RSPO2甲基化状态对结直肠癌具有较高的检出率及特异性。