转Bt基因棉花抗棉铃虫性评价方法

摘要

本发明涉及生物防治领域，具体地涉及转Bt基因棉花抗棉铃虫性评价方法。所述方法包括以下步骤：在第二代、第三代和第四代棉铃虫发生期，采集叶片，以非转基因棉花品种为对照材料；将叶片置于盒内；接棉铃虫初孵幼虫；接虫后调查棉铃虫幼虫死亡数和龄期，进行统计分析，计算棉铃虫龄期抑制率。本发明的方法，采样量相对较少，可以只接1头棉铃虫，既可以省工，也省试虫，相当于省工省时。本发明的方法从二代、三代和四代棉铃虫发生期单独进行评价，能准确反应棉花生长发育过程中外源蛋白抗棉铃虫的作用和效果，同时对于延长抗虫棉寿命。该方法用虫量大幅减少，方法简便，易操作，准确、客观、可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及生物防治领域，具体地涉及转Bt基因棉花抗棉铃虫性评价 方法。

背景技术

上世纪九十年代棉铃虫连年暴发为害，给我国棉花生产带来巨大威胁 ，棉花产量损失达40%～60%，局部棉区达80%以上，甚至绝产，全国棉 花损失400多亿元。1997年转基因抗虫棉在我国大面积应用，有效的控 制了棉铃虫的暴发为害，促进了我国棉花的持续稳定发展。至2006年 ，全国抗虫棉面积已达350万公顷，占我国棉花面积的66%，其中黄河 流域抗虫棉面积占98%以上，河南、河北、山东、安徽等省抗虫棉实现 100%种植。

由于转Bt基因棉的毒素能在棉株内持续表达，但随着棉花植株的生长 和发育，外源蛋白在植株体内的表达量一般呈现逐步下降的趋势，同 时也和棉田棉铃虫发生量和危害程度呈一致的趋势。棉花苗期、蕾期 和花铃期外源蛋白表达量在不同棉花材料上表现不一致，且下降幅度 也不相同，而棉铃虫在二代、三代和四代的发生量和聚集程度呈逐步 减轻的程度。因此棉花对棉铃虫的抗性评价应根据转基因棉花外源蛋 白的表达量特性和棉铃虫的发生和危害程度变化进行综合评价。

由于现有的棉花抗棉铃虫性生物测定方法，取样量和接虫量均很大， 费时费工。现有的棉花抗棉铃虫性生物测定方法取样量最少是设重复 20片叶片，三次重复，每叶片接5头试虫。因为现有的生测方法是以试 虫的死亡率为评判指标，如果接入试虫5头，每死1头试虫，死亡率为 20%，还有其余4头，则说明该叶片对试虫的抗性死亡率为20%，如果每 叶片只接1头，则这个叶片的死亡率为100%，即该叶片对试虫的抗性死 亡率为100%，不能正确、客观的反应叶片对试虫的抗性程度。本发明 的方法是每叶片接1头试虫，调查结果时只登记试虫的生长的龄期，如 果试虫死亡，则龄期记为0，更能体现在逆境条件下，试虫的生长非正 常情况，从而反映除了棉花对棉铃虫的抗性程度。此外，二代、三代 和四代棉铃虫发生期，棉花植株外源Bt杀虫蛋白表达量均呈现降低的 趋势，而现有的抗性鉴定方法为同一个判定标准，对于后期棉花外源 蛋白整体下降造成评价上的误差。

发明内容

本发明的发明人为了解决上述问题提出并完成了本发明。

本发明的目的是提供一种采样量少、方法简便、易操作且客观的棉花 抗棉铃虫性评价方法。

本发明的棉花抗棉铃虫性评价方法包括以下步骤：

1、棉花抗棉铃虫性评价方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

（1）在第二代、第三代和第四代棉铃虫发生期，分别采集棉花顶部第 二片完全展开叶片，以非转基因棉花品种为对照材料；

（2）将采集的新鲜叶片置于实验盒内；

（3）在放有叶片的实验盒内接棉铃虫初孵幼虫，拧紧盒盖，置于室温 下；

（4）接虫后调查棉铃虫幼虫死亡数和龄期；如果试虫死亡，则龄期记 为0；

（5）进行统计分析，计算棉铃虫龄期抑制率，以二、三代和四代棉铃 虫发生期龄期抑制率为判定抗性级别指标，其中龄期抑制率计算公式 如下：

根据本发明的具体实施方式，本发明的抗蚜性鉴定方法包括以下步骤 ：

（1）在第二代、第三代和第四代棉铃虫发生期，分别采集棉花顶部第 二片完全展开叶10片-20片，以非转基因棉花品种为对照材料；

（2）将采集的新鲜叶片置于具有保鲜作用的实验盒内，每盒一片；

（3）在放有叶片的实验盒内接1头1d龄棉铃虫初孵幼虫，拧紧盒盖， 置于室温下；

（4）接虫后第5d调查棉铃虫幼虫死亡数和龄期；如果试虫死亡，则龄 期记为0；

（5）进行统计分析，计算棉铃虫龄期抑制率，以二、三代和四代棉铃 虫发生期龄期抑制率为判定抗性级别指标。

例如，根据本发明的具体实施方式，抗性级别的判断标准如下。

根据本发明的方法，采样量相对较少，可以只接1头棉铃虫，既可以省 工，也省试虫，相当于省工省时。本发明的方法从二代、三代和四代 棉铃虫发生期单独进行评价，能准确反应棉花生长发育过程中外源蛋 白抗棉铃虫的作用和效果，同时对于延长抗虫棉寿命。该方法用虫量 大幅减少，方法简便，易操作，准确、客观、可靠。

具体实施方式

实施例1

（1）在第二代、第三代和第四代棉铃虫发生期，分别采集棉花顶部第 二片完全展开叶10片-20片；以非转基因棉花品种为对照材料；

（2）将采集的新鲜叶片置于具有保鲜作用的实验盒内，每盒一片；

（3）在放有叶片的实验盒内接1头1d龄棉铃虫初孵幼虫，拧紧盒盖， 置于室温下；

（4）接虫后第5d调查棉铃虫幼虫死亡数和龄期；如果试虫死亡，则龄 期记为0；

（5）进行统计分析，计算棉铃虫龄期抑制率，以二、三代和四代棉铃 虫发生期龄期抑制率为判定抗性级别指标（参见表1）；

（6）实验结果如以下表2所示：

表1抗性级别的判断标准

表2 不同棉花材料室内生物测定结果

在本实施例中，所使用的转基因棉花材料A2、B4、C4和D2（参见表2） 为随机从2011年黄河流域国家区域试验材料中选择并进行评价其抗性 的，该四份转基因棉花材料本评价结果均达到抗级，与2011年网室鉴 定结果一致。表明该方法用虫量大 幅减少，方法简便，易操作，且评价结果准确、客观、可靠。

实施例2

2012年用现有的棉花抗棉铃虫鉴定方法《转基因植物及其产品环境安 全检测 

抗虫棉花 第1部分（农业部953号公告-12-2007）》，对表2中A2、B 4、C4和D2四个棉花材料进行了生物测定,实验步骤和鉴定结果如下；

1、取样方法

在靶标害虫二、三、四代发生盛期，分别从转基因抗虫品种田、感虫 对照品种田采集顶部展开的第三片棉叶，每处理每小区随机采集20片 。

2、 操作

在大试管（35 mm×120 mm）中加入20 mm的琼脂培养基，将叶片（ 保留叶柄）插入培养基中保鲜，每试管放一张叶片，每张叶片接棉铃 虫1 d 龄幼虫5头。接虫后用脱脂棉塞紧管口，以防棉铃虫逃逸；放 于25～28℃的养虫室或培养箱中饲养。

3、结果记录

接虫后第5 d 检查幼虫取食状况和幼虫死亡状况。记录幼虫死亡虫 数和活虫数，目测幼虫取食状况，幼虫取食状况级别按附录表A-1、A -2执行。

幼虫死亡率按公式（1）计算：

$X=\frac{n}{A}\times 100---\left(1\right)$

式中：

X：幼虫死亡率，单位为%；

n：死虫数，单位为头；

A：接虫数，单位为头。

校正死亡率按公式（2）计算：

$\mathrm{Xt}=\frac{X1-X0}{1-X0}\times 100---\left(2\right)$

式中：

Xt：幼虫校正死亡率，单位为%；

X1：处理死亡率，单位为%；

X0：对照死亡率，单位为%。

4、结果分析

判定转基因抗虫棉的抗虫性。转基因抗虫棉抗虫性级别判定标准按附 录A执行。

附录A

表A-1  转基因抗虫棉抗虫性评定标准

抗性级别 幼虫校正死亡率Y(%) 叶片受害级别 高抗（1级） Y>80 1 抗（2级） 50<Y≤80 2 中抗（3级） 30<Y≤50 3 低抗（4级） Y≤30 4 感（5级） 同对照品种 5

表A-2  棉铃虫幼虫取食转基因抗虫棉叶片状况目测分级标准

叶片受害级别 取食状况描述 1 受害呈针头状不连片 2 受害呈小片，但不超过叶面积的25% 3 被害成片，超过叶面积的25%，但不超过叶面积的50% 4 被害成片，超过叶面积的50% 5 叶片被大量取食，被害同常规对照品种

5、鉴定结果

表3 转基因棉花抗棉铃虫性鉴定结果

实施例3

2012年用现有的转Bt棉花外源蛋白表达量检测标准《转基因植物及其 产品成分检测 抗虫转Bt基因棉花外源蛋白表达量检测技术规范（农 业部1485号公告-14-2010）》对A2、B4、C4和D2四个棉花材料外源蛋 白表达量进行了检测,检测结果如下：

1、检测方法

本试验操作均按检测试剂盒说明书严格进行，检测试剂盒为美国Envi rologix公司生产的Cry1Ac/Cry1Ab检测试剂盒。

2、检测结果

转基因棉花外源蛋白表达量检测结果