一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法

摘要

本发明提供一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法，涉及基因工程技术领域，本发明所述的大豆遗传转化方法以PMI基因为筛选标记，以带有PMI基因和目的基因的重组农杆菌侵染大豆外植体后进行共培养；将共培养后的外植体不经过恢复培养，直接用含有甘露糖的筛选培养基筛选，含有PMI基因的转化外植体可以在甘露糖筛选压力下正常生长，非转化的外植体生长则受到抑制，从而筛选出转化成功的阳性植株；对得到的阳性植株进行芽伸长培养和移栽后，即可成功得到遗传转化后的大豆植株。本发明提供的大豆遗传转化方法可采用任何物种来源的PMI基因对大豆进行遗传转化，实现了大豆的安全遗传转化。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法。

背景技术

植物遗传转化常用的筛选标记为抗生素和除草剂抗性基因，广泛应用到双子叶和单子叶植物遗传转化中。但转基因安全法规对一些抗生素和除草剂有明确的限制，主要源于两方面的担忧，一方面因为这两种筛选剂都有一定的毒性，生产中的使用可能会对环境造成影响。另一方面是人们在种植含有抗生素基因的转基因作物时，可能会造成基因的横向转移(Pontiroli et al.,2007；Rizzi et al.,2011)，转移到土壤或其他作物中，影响环境中的菌群平衡，进而影响人类的健康。为了避免筛选标记基因给环境带来的可能风险，人们也通过各种方式去避免这些只在转化过程中需要的筛选标记基因对产品的影响。如共转化后再分离的方法，同源重组删除筛选基因的方法和运用基因编辑手段将筛选标记基因删除等方法(Srivastava et al.,2004；Yau et al.,2013；Caliando et al.,2015；Sticklenet al.,2015)。

然而，这些方法都需要大量的检测、分析和筛选，甚至是做额外的转化实验，这些都将大大提高生产成本和劳动力。对非抗生素和除草剂类型的筛选标记基因的需求应运而生，如6-磷酸甘露糖异构酶基因(PMI)。甘露糖对植物细胞没有伤害，但不能被植物直接吸收和利用，只有被6-磷酸甘露糖异构酶异构化成6磷酸果糖后，才能被植物吸收利用。因此，调节培养基中的甘露糖和蔗糖比例，可以给非转化的植物细胞造成饥饿，从而使转化细胞正常生长。

6-磷酸甘露糖异构酶基因已经被广泛应用于单子叶植物，如水稻、玉米和小麦的遗传转化(Zhong et al.,2018；Wright et al.,2001；Negrotto et al.,2000；Boscariolet al.,2003；Zhi et al.,2015；Hu et al.,2016；Qiu et al.,2015)。双子叶植物中应用该基因作为筛选标记的研究较少，转化频率高低不一。如马铃薯的转化频率最高达到50％左右，而甘蓝的转化频率只有1.2％(Nawiri et al.,2017；Hur et al.,2015)。原因可能是有些双子叶植物中的内源PMI基因表达较高，能够吸收和利用甘露糖。尤其在大豆遗传转化中，人们普遍认为PMI基因无法作为筛选标记。

发明内容

本发明为了克服现有技术中PMI基因无法作为大豆遗传转化的筛选标记的缺陷，提供了一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法，实现了大豆安全遗传转化。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)以包括重组农杆菌的侵染液浸泡大豆外植体，得到侵染后的外植体；

所述重组农杆菌中含有PMI基因和目的基因；

所述侵染液除了重组农杆菌外，还包括侵染培养基，所述侵染培养基以MS为基础培养基，还包括1.0～2.0mg/L的噻苯隆；

(2)对侵染后的外植体进行共培养，得到共培养后的外植体；

(3)以筛选培养基直接对共培养后的外植体培养18～25d，选取生长未受抑制的阳性植株；

所述筛选培养基以甘露糖为筛选剂；

(4)对所述阳性植株进行芽伸长培养，移栽。

优选的，所述步骤(1)中，大豆外植体包括大豆胚尖生长点外植体或大豆愈伤组织。

优选的，所述大豆外植体的品种包括Jack、William82、中黄10或中黄688。

优选的，所述步骤(1)中，侵染培养基以MS为基础培养基，还包括B5维生素、蔗糖、噻苯隆和2-吗啉乙磺酸。

优选的，所述步骤(1)中，PMI基因来源于微生物或植物，所述微生物包括大肠杆菌，所述植物包括大豆、水稻或玉米。

优选的，所述步骤(2)中，共培养的培养基以MS为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8。

优选的，所述共培养的培养条件包括：培养温度19～24℃，光照时间0～18h/d。

优选的，所述步骤(3)中，筛选培养基以B5为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、甘露糖、噻苯隆、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8。

优选的，步骤(3)所述的培养条件包括：培养温度25～28℃，光照时间14～18h/d。

优选的，所述步骤(4)中，芽伸长培养的培养基以B5为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、甘露糖、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8。

优选的，所述步骤(4)中，芽伸长培养的条件包括：培养温度25～28℃，光照时间14～18h/d。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法，以PMI基因为筛选标记，以带有PMI基因和目的基因的重组农杆菌侵染大豆外植体后进行共培养；将共培养后的外植体不经过恢复培养，直接用含有甘露糖的筛选培养基筛选，含有PMI基因的转化外植体可以在甘露糖筛选压力下正常生长，非转化的外植体生长则受到抑制，从而筛选出转化成功的阳性植株；对得到的阳性植株进行芽伸长培养和移栽后，即可成功得到遗传转化后的大豆植株。PMI基因(6-磷酸甘露糖异构酶基因)将甘露糖转化为6-磷酸果糖才能被植物利用，大豆基因组中的PMI基因表达量不足以使其利用培养基中的甘露糖维持细胞生长。因此，只有在大豆基因组中过表达PMI基因，才能使细胞和组织可以利用甘露糖，在含有甘露糖的培养基上正常生长。通常人们认为大豆中的PMI基因表达量足以支撑其利用甘露糖，不能使用PMI作为筛选标记。本发明打破传统观念，更改大豆转化外植体和改进筛选压力及培养流程，建立了大豆PMI筛选体系。通过调节筛选培养基中的甘露糖浓度，可达到抑制非转化细胞生长以及促进转化细胞再生的作用。按照本发明所述的大豆遗传转化方法，不同品种的转化频率为1.9％～6.3％

本发明提供的大豆遗传转化方法可采用任何物种来源的PMI基因对大豆进行遗传转化，对转基因产品的环境安全和大豆遗传转化具有重要价值。

附图说明

图1为实施例9中四个农杆菌侵染较好的大豆品种GUS染色结果；

图2为实施例10中Jack转化株的GUS染色结果。

具体实施方式

本发明提供了一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)以包括重组农杆菌的侵染液浸泡大豆外植体，得到侵染后的外植体；

所述重组农杆菌中含有PMI基因和目的基因；

所述侵染液除了重组农杆菌外，还包括侵染培养基，所述侵染培养基以MS为基础培养基，还包括1.0～2.0mg/L的噻苯隆；

(2)对侵染后的外植体进行共培养，得到共培养后的外植体；

(3)以筛选培养基直接对共培养后的外植体培养18～25d，选取生长未受抑制的阳性植株；

所述筛选培养基以甘露糖为筛选剂；

(4)对所述阳性植株进行芽伸长培养，移栽。

本发明以包括重组农杆菌的侵染液浸泡大豆外植体，得到侵染后的外植体。利用重组农杆菌将PMI基因和目的基因转化至大豆外植体中。农杆菌侵染是本领域的常规方法，本发明未作说明的部分按照常规手段即可。

在本发明中，所述PMI基因可以来源于任何物种，包括但不限于微生物或植物；所述PMI基因的微生物来源包括但不限于大肠杆菌；所述PMI基因的植物来源包括但不限于大豆、水稻或玉米。

在本发明中，所述重组农杆菌的构建方法优选的可按照下述方法进行：将PMI基因和目的基因克隆至同一表达载体中，构建得到重组表达载体；重组表达载体导入农杆菌内，即得重组农杆菌。本发明所述方法适用于任何目的基因的遗传转化，对于目的基因不做特殊限定。

在本发明中，所述大豆外植体包括但不限于大豆胚尖生长点外植体或大豆愈伤组织。在本发明中，所述大豆外植体的品种包括但不限于Jack、William82、中黄10或中黄688。本发明所述的大豆遗传转化方法对各种基因型的大豆均适用。

在本发明中，所述侵染时，优选的将所述重组农杆菌配制成OD₆₆₀值0.6～1.0的侵染液；更优选的，所述侵染液包括侵染培养基和重组农杆菌；进一步优选的，所述侵染培养基以MS为基础培养基，还包括B5维生素、蔗糖、噻苯隆和2-吗啉乙磺酸；更进一步优选的，所述侵染培养基包括MS基础培养基0.15～0.3g/L、200×维生素B52～10ml/L、蔗糖20～50g/L、噻苯隆1.0～2.0mg/L和2-吗啉乙磺酸0.5～3g/L，pH值5.2～5.6。本发明限定的侵染培养基中噻苯隆浓度可显著提高大豆遗传转化的转化频率。

在本发明中，所述侵染的方式优选为浸泡，即以含有所述重组农杆菌的侵染液对待转化的大豆外植体进行浸泡。在本发明中，所述浸泡时的温度优选为25～28℃。在本发明中，所述浸泡的时间优选为0.5～4h，更优选为1～2h。

得到侵染后的外植体后，本发明对侵染后的外植体进行共培养，得到共培养后的外植体。本发明进行共培养的目的是将农杆菌中的含有PMI基因和目标基因的T-DNA更好的整合进大豆基因组中。

在本发明中，所述共培养的培养基优选的以MS为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8；更优选的，所述共培养的培养基包括MS基础培养基0.15～0.3g/L、200×维生素B52～10ml/L、蔗糖20～50g/L、2-吗啉乙磺酸0.5～3g/L和琼脂6～9g/L，pH值5.2～5.6。本发明所述的MS基础培养基为市售的试剂，直接称量使用即可。在本发明中，所述共培养的温度优选为19～24℃，更优选为20～22℃。在本发明中，所述共培养的光照时间优选为0～18h/d，更优选为14～16h/d。在本发明中，所述共培养的时间优选为4～5d。

得到共培养后的外植体后，本发明以筛选培养基直接对共培养后的外植体培养18～25d，选取生长未受抑制的阳性植株；所述筛选培养基以甘露糖为筛选剂。本发明将共培养后的外植体直接进行筛选，可有效提高PMI为筛选标签时的遗传转化频率。通过筛选培养基中的甘露糖胁迫，可以使带有筛选标记PMI基因的转化植株正常生长，抑制非转化植株的生长，从而筛选出成功转化的阳性植株。

在本发明中，所述筛选培养基优选的筛选培养基以B5为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、甘露糖、噻苯隆、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8；更优选的，所述筛选培养基包括：B5基础培养基0.25～0.5g/L、200×维生素B52～8ml/L、蔗糖0～60g/L、甘露糖10～40g/L、噻苯隆0.2～0.3mg/L、2-吗啉乙磺酸0.5～2g/L和琼脂6～10g/L，pH值5.4～5.8；所述筛选培养基中的蔗糖优选为20～60g/L。本发明所述B5基础培养基为市售试剂，直接称量使用即可。

在本发明中，筛选培养基的培养时，培养温度优选为25～28℃；培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d；培养的时间优选为20～22d；培养的光照强度优选为1500LUX以上。

得到阳性植株后，本发明对所述阳性植株进行芽伸长培养，移栽。本发明所述芽伸长培养和移栽可以采用本领域已知的方式进行；本发明优选的提供下述方法进行芽伸长培养：

在本发明中，所述芽伸长培养的培养基优选的以B5为基础培养基，还包括维生素B5、蔗糖、甘露糖、2-吗啉乙磺酸和琼脂，pH值5.4～5.8；更优选的，所述芽伸长培养的培养基包括：B5基础培养基0.25～0.5g/L、200×维生素B52～8ml/L、蔗糖0～60g/L、甘露糖10～40g/L、2-吗啉乙磺酸0.5～2g/L和琼脂6～10g/L，pH值5.4～5.8；所述芽伸长培养的培养基中的蔗糖优选为20～60g/L。

在本发明中，所述芽伸长培养的培养温度优选为25～28℃。在本发明中，所述芽伸长培养的光照时间优选为14～18h/d，更优选为16h/d。在本发明中，所述芽伸长培养的时间优选为19～22d。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以Jack品种的大豆为模式受体，以PMI基因为筛选条件，建立大豆PMI筛选的遗传转化体系。

一、制备外植体：将Jack成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

对比例1

以Jack和中黄688品种的大豆为模式受体，以PMI基因为筛选条件，建立大豆PMI筛选的遗传转化体系。

一、制备外植体：将Jack成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、恢复培养：共培养后的外植体，转移至不含有甘露糖的恢复培养基，25℃培养7天。光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

恢复培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、筛选培养：将恢复培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

六、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

七、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

实施例1和对比例1的区别仅在于，对比例1在共培养后以恢复培养基培养了7d，实施例1则在共培养后直接将外植体接入筛选培养基。分别统计实施例1和对比例1的转化频率(转化频率＝阳性植株数/外植体数×100％)。

结果如表1所示，实施例1所述方法的转化频率为3.1％，而对比例所述方法的转化频率仅为0.5％，表明共培养后恢复培养的转化频率明显低于无恢复培养的转化频率，即本发明提供的方法可显著提高PMI基因为筛选标记时的大豆遗传转化效率。

表1不同恢复培养的转化频率

实施例2

一、制备外植体：将Jack成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到大豆胚尖生长点外植体38个。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.2g、200×B5维生素4ml、蔗糖30g、塞苯隆1.2mg、2-吗啉乙磺酸1.5g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.8，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中4小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，25℃、暗培养条件下培养4天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.2g、200×B5维生素5ml、蔗糖35g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.2g、200×B5维生素5ml、蔗糖40g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，26℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为14小时光照，10小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：27℃光照培养，18小时光照，6小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

实施例3

除制备得到45个大豆胚尖生长点外植体、筛选培养基中的甘露糖含量为15g/L、蔗糖含量为10g/L外，其余步骤均与实施例2相同。

实施例4

除制备得到46个大豆胚尖生长点外植体、筛选培养基中的甘露糖含量为5g/L、蔗糖含量为25g/L外，其余步骤均与实施例2相同。

实施例5

除制备得到53个大豆胚尖生长点外植体、筛选培养基中的甘露糖含量为15g/L、蔗糖含量为7.5g/L外，其余步骤均与实施例2相同。

实施例6

除采用了与实施例2不同的大豆种子来源、制备得到204个大豆胚尖生长点外植体外，其余步骤均与实施例2相同。

实施例7

除采用了与实施例4不同的大豆种子来源、制备得到62个大豆胚尖生长点外植体外，其余步骤均与实施例4相同。

分别统计实施例2～7所述方法的再生植株数、外植体总数和GUS阳性植株数，计算再生频率和转化频率。其中，

再生频率＝(再生植株数(每个外植体只计算一株再生植株)/外植体数)×100％；

转化频率(TF)＝(GUS阳性植株数/外植体数)×100％。

结果如表2，在本发明限定的四种筛选培养基浓度下均可实现对大豆的遗传转化。其中，“20g甘露糖+5g蔗糖”的组合最为适合用于Jack品种转化的PMI筛选，其转化频率为5.3％和4.4％，高于其他处理。

表2不同筛选培养基中甘露醇和蔗糖浓度的转化频率

实施例8

以Jack和中黄688品种的大豆为模式受体，以PMI基因为筛选条件，建立大豆PMI筛选的遗传转化体系。

一、制备外植体：将Jack成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.5，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.8，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中0.5小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养4天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.5。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素6ml、蔗糖25g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.5。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素6ml、蔗糖5g、甘露糖22g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.5。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

实施例9

除了侵染培养基中的噻苯隆含量为2.0mg/L外，其余步骤均与实施例1相同。

对比例2

除了侵染培养基中的噻苯隆含量为0.5mg/L外，其余步骤均与实施例1相同。

分别统计实施例8～9和对比例2所述方法的再生植株数、GUS阳性植株数、再生频率和转化频率。

结果如表3所示，噻苯隆(TDZ)浓度为1mg/L和2mg/L时均可以用于侵染培养基，以提高再生和转化频率，且二者的差别不大。而0.5mg/L的TDZ则无法获得转基因阳性植株。

表3侵染培养基中不同TDZ浓度的转化频率

实施例10

以中黄688(ZH688)品种的大豆为模式受体，以PMI基因为筛选条件，建立大豆PMI筛选的遗传转化体系。

一、制备外植体：将中黄688成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

对比例3

除筛选培养基中的噻苯隆(TDZ)的浓度为0.1mg/L外，其余步骤均相同。

分别统计实施例10和对比例3所述方法的再生植株数、GUS阳性植株数、再生频率和转化频率。

结果如表4所示，筛选培养基中添加两种浓度的TDZ，所获得的再生频率差异不大，但转化频率差异非常大，分别为1.2％和6.3％。

表4筛选培养基中不同TDZ浓度的转化频率

实施例11

以大肠杆菌来源的PMI基因作为筛选标记，以Jack、Williams82、中黄10、中黄37、黑河45、金源55和中黄688品种的大豆外植体为受体，进行遗传转化：

一、制备外植体：分别将Jack、Williams82、中黄10、中黄37、黑河45、金源55和中黄688品种的大豆成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到Jack、Williams82、中黄10、中黄37、黑河45、金源55和中黄688品种的大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大肠杆菌EcoliPMI基因序列(如SEQ ID NO.1所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

农杆菌侵染的瞬时表达测试：取部分共培养后的外植体，放置于GUS染色液中，染色12小时后，70％酒精脱色，统计被染色外植体个数及染色强度。计算GUS阳性比例(GUS阳性比例＝染色外植体个数/被染色外植体总数×100％)。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

GUS染色鉴定：取伸长的植株叶片，放置于GUS染色液中，37℃放置12小时。取出材料，经70％酒精脱色，后观察叶片颜色，染色为蓝色的叶片极为转基因阳性植株。

GUS染色液的配制：1M磷酸钠(Na₂PO₄)25ml、500mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)5ml和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖糖苷(X-Glu)125mg溶于水，调pH为8.0。

对Jack、Williams 82、中黄10、黑河45、金源55、中黄37和中黄688进行农杆菌侵染和共培养，共培养后的外植体GUS染色结果显示，Jack、Williams 82、中黄10、黑河45和中黄688可以被农杆菌侵染并被染色(表5)。但Jack、Williams82、中黄10和中黄688侵染效果较好。图1为该四个品种的瞬时表达染色图片。

表5不同品种的农杆菌侵染瞬时表达结果

实施例12

按照实施例11所示的方法，以大肠杆菌来源的E.coliPMI为筛选标记，对Jack、Williams82、中黄10和中黄688进行三个批次转化试验，统计每个批次试验中的外植体数、阳性植株数，计算转化频率(转化频率＝阳性植株数/外植体数×100％)。

统计结果如表6所示，Jack、Williams 82、中黄10和中黄688的转化频率分别为5.1％、1.9％、3.1％和6.3％(表6)。图2为转化植株的GUS染色图片。

表6不同品种的PMI筛选转化频率

实施例13

大豆来源的PMI基因(GmPMI-Glyma.18G296300.1)作为筛选标记的大豆遗传转化：

一、制备外植体：分别将Jack品种的大豆成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到Jack品种的大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大豆来源的PMI基因(GmPMI-Glyma.18G296300.1，如SEQ ID NO.2所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

GUS染色鉴定：取伸长的植株叶片，放置于GUS染色液中，37℃放置12小时。取出材料，经70％酒精脱色，后观察叶片颜色，染色为蓝色的叶片极为转基因阳性植株。

GUS染色液的配制：1M磷酸钠(Na2PO4)25ml、500mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)5ml和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖糖苷(X-Glu)125mg溶于水，调pH为8.0。

按照上述试验重复三次，统计外植体个数和再生阳性植株数，并计算转化频率(转化频率＝阳性植株数/外植体数×100％)。

结果显示，两个大豆来源的PMI基因均可以作为大豆遗传转化中的筛选标记基因，分别获得转化频率为4.8％和5.5％(表7)。

表7大豆来源PMI基因在大豆遗传转化中的转化频率

实施例14

大豆来源的PMI基因(GmPMI-Glyma.08G365900.1)作为筛选标记的大豆遗传转化：

一、制备外植体：分别将Jack品种的大豆成熟种子灭菌后，在固体培养基中萌发1天，去掉两片子叶及第一对真叶，所留下的胚轴和生长点，得到Jack品种的大豆胚尖生长点外植体。

二、侵染液制备：将MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、塞苯隆1.0mg、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.4，得到侵染培养基。

载体构建：双元载体pCAMBIA3301作为转化的基础载体构建表达载体。NCBI网站获得大豆来源的PMI基因(GmPMI-Glyma.08G365900.1，如SEQID NO.3所示)，合成基因片段，并克隆至双元载体pCAMBIA3301，得到重组表达载体。重组表达载体中含有两个表达元件，一是用于瞬时表达分析的GUS表达元件：pr35S-GUS-tNOS；另一个是用于筛选的筛选标记基因：pr35S-EcoliPMI-tNOS。使用电激转化法将该双元载体导入农杆菌EHA101中，经验证无误，得到重组农杆菌，存入-80℃冰箱备用。

将重组农杆菌培养后溶于该侵染培养基中，测OD₆₆₀为0.6，即得侵染液。

三、侵染和共培养：将大豆胚尖生长点外植体浸泡在侵染液中2小时，取出侵染后的外植体，放置于共培养培养基表面或含有1ml液体共培养基的滤纸表面，23℃、暗培养条件下培养5天。

共培养培养基为：MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

液体共培养培养基为MS基础培养基0.215g、200×B5维生素5ml、蔗糖30g、2-吗啉乙磺酸1g溶于1L水，调pH值5.6。

四、筛选培养：将共培养后的外植体转移至含有甘露糖的筛选培养基中，25℃培养3周，选取正常生长的外植体为阳性植株。培养期间光照条件为16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

筛选培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、塞苯隆0.2mg、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g溶于1L水，调pH值5.6。

五、芽伸长培养：将筛选所得阳性植株转移至芽伸长培养基，继续培养3周，得到伸长的植株。培养条件为：25℃光照培养，16小时光照，8小时黑暗。光照度大于1500LUX。

芽伸长培养基包括：B5基础培养基0.31g、200×B5维生素5ml、蔗糖5g、甘露糖20g、2-吗啉乙磺酸1g和琼脂7.5g，调pH值5.6。

六、移栽及染色鉴定：伸长的植株进行GUS染色鉴定，染色后的伸长植株无需生根，直接移栽入培养基质中。移栽后浇水并用塑料袋保湿，1周后，取下塑料袋，正常管理。

培养基质为草炭土：蛭石体积比1:1混合。培养条件：28℃，16小时光照，8小时黑暗。

GUS染色鉴定：取伸长的植株叶片，放置于GUS染色液中，37℃放置12小时。取出材料，经70％酒精脱色，后观察叶片颜色，染色为蓝色的叶片极为转基因阳性植株。

GUS染色液的配制：1M磷酸钠(Na₂PO₄)25ml、500mM乙二胺四乙酸二钠(EDTA)5ml和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-吡喃葡萄糖糖苷(X-Glu)125mg溶于水，调pH为8.0。

按照上述试验重复三次，统计外植体个数和再生阳性植株数，并计算转化频率(转化频率＝阳性植株数/外植体数×100％)。

结果显示，两个大豆来源的PMI基因均可以作为大豆遗传转化中的筛选标记基因，转化频率为5.5％(表8)。

表8大豆来源PMI基因在大豆遗传转化中的转化频率

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> 一种以PMI为筛选基因的大豆遗传转化方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 391

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 1

Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys

1 5 1015

Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Met Glu Asn Pro Ser Ser Gln Pro

202530

Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser Ser Arg Val

354045

Gln Asn Ala Ala Gly Asp Ile Val Ser Leu Arg Asp Val Ile Glu Ser

505560

Asp Lys Ser Thr Leu Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe Gly Glu

65707580

Leu Pro Phe Leu Phe Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ile

859095

Gln Val His Pro Asn Lys His Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys Glu

100 105 110

Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn Tyr Lys Asp

115 120 125

Pro Asn His Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Phe Leu Ala

130 135 140

Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Glu Ile Val Ser Leu Leu Gln Pro

145 150 155 160

Val Ala Gly Ala His Pro Ala Ile Ala His Phe Leu Gln Gln Pro Asp

165 170 175

Ala Glu Arg Leu Ser Glu Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly

180 185 190

Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Ile Leu Lys Ser Ala Leu Asp Ser

195 200 205

Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Leu Ile Ser Glu Phe Tyr

210 215 220

Pro Glu Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn Val Val Lys

225 230 235 240

Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr Pro His Ala

245 250 255

Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser Asp Asn Val

260 265 270

Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro Glu Leu Val

275 280 285

Ala Asn Val Lys Phe Glu Ala Lys Pro Ala Asn Gln Leu Leu Thr Gln

290 295 300

Pro Val Lys Gln Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp

305 310 315 320

Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys Glu Thr Thr Ile Ser

325 330 335

Gln Gln Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Asp Ala Thr Leu

340 345 350

Trp Lys Gly Ser Gln Gln Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe

355 360 365

Ile Ala Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys Gly His Gly Arg Leu

370 375 380

Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu

385 390

<210> 2

<211> 400

<212> PRT

<213> Glycine max (Linn.) Merr.

<400> 2

Met Glu Asp Ala Asn Leu Gln Arg Leu His Cys Ser Val Lys Asn Tyr

1 5 1015

Asp Trp Gly Leu Pro Gly Arg Val Ser Glu Val Ala Arg Leu His Ala

202530

Leu Asn Ser Ala Ser Glu Phe His Ala Glu Asp Pro Tyr Ala Glu Leu

354045

Trp Met Gly Thr His Asp Ser Gly Pro Ser Phe Leu Ala Ser Ser Asn

505560

Gly Asn Glu Asn Gly Val Ser Leu Lys Ala Trp Ile Ser Glu Asn Pro

65707580

Asp Val Leu Gly His Lys Val Leu His Lys Trp Gly Ser Asp Leu Pro

859095

Phe Leu Phe Lys Val Leu Ser Val Gly Lys Ala Leu Ser Ile Gln Ala

100 105 110

His Pro Asp Lys Glu Leu Ala Arg Thr Leu His Lys Leu His Pro Asp

115 120 125

Leu Tyr Lys Asp Gly Asn His Lys Pro Glu Met Ala Leu Ala Leu Thr

130 135 140

Asn Phe Glu Ala Leu Cys Gly Phe Ile Thr Leu Lys Glu Leu Lys Gly

145 150 155 160

Val Leu His Thr Val Pro Glu Ile Val Glu Leu Val Gly Ala Thr Asn

165 170 175

Thr Asn Leu Val Leu Gln Thr Asn Asp Gln Asp Gly Glu Glu Lys Val

180 185 190

Lys Pro Val Leu Gln Ala Val Phe Thr Asp Leu Met Ser Ala Ser Lys

195 200 205

Asp Arg Val Thr Asp Ala Val Asn Arg Leu Lys Ser Arg Leu Leu Lys

210 215 220

Glu Ser Glu Val Arg Gln Leu Thr Asp Lys Glu Gln Leu Val Leu Arg

225 230 235 240

Leu Glu Lys Gln Tyr Pro Ala Asp Val Gly Val Ile Ala Ala Phe Phe

245 250 255

Leu Asn His Val Lys Leu Asn Pro Gly Glu Ala Leu Phe Leu Gly Ala

260 265 270

Asn Glu Pro His Ala Tyr Leu Ser Gly Glu Cys Val Glu Cys Met Ala

275 280 285

Thr Ser Asp Asn Val Val Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys His Arg Asp

290 295 300

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> Glycine max (Linn.) Merr.

<400> 3

Met Gln Lys Leu Ile Asn Ser Val Gln Asn Tyr Ala Trp Gly Ser Lys

1 5 1015

Thr Ala Leu Thr Glu Leu Tyr Gly Met Glu Asn Pro Ser Ser Gln Pro

202530

Met Ala Glu Leu Trp Met Gly Ala His Pro Lys Ser Ser Ser Arg Val

354045

Gln Asn Ala Ala Gly Asp Ile Val Ser Leu Arg Asp Val Ile Glu Ser

505560

Asp Lys Ser Thr Leu Leu Gly Glu Ala Val Ala Lys Arg Phe Gly Glu

65707580

Leu Pro Phe Leu Phe Lys Val Leu Cys Ala Ala Gln Pro Leu Ser Ile

859095

Gln Val His Pro Asn Lys His Asn Ser Glu Ile Gly Phe Ala Lys Glu

100 105 110

Asn Ala Ala Gly Ile Pro Met Asp Ala Ala Glu Arg Asn Tyr Lys Asp

115 120 125

Pro Asn His Lys Pro Glu Leu Val Phe Ala Leu Thr Pro Phe Leu Ala

130 135 140

Met Asn Ala Phe Arg Glu Phe Ser Glu Ile Val Ser Leu Leu Gln Pro

145 150 155 160

Val Ala Gly Ala His Pro Ala Ile Ala His Phe Leu Gln Gln Pro Asp

165 170 175

Ala Glu Arg Leu Ser Glu Leu Phe Ala Ser Leu Leu Asn Met Gln Gly

180 185 190

Glu Glu Lys Ser Arg Ala Leu Ala Ile Leu Lys Ser Ala Leu Asp Ser

195 200 205

Gln Gln Gly Glu Pro Trp Gln Thr Ile Arg Leu Ile Ser Glu Phe Tyr

210 215 220

Pro Glu Asp Ser Gly Leu Phe Ser Pro Leu Leu Leu Asn Val Val Lys

225 230 235 240

Leu Asn Pro Gly Glu Ala Met Phe Leu Phe Ala Glu Thr Pro His Ala

245 250 255

Tyr Leu Gln Gly Val Ala Leu Glu Val Met Ala Asn Ser Asp Asn Val

260 265 270

Leu Arg Ala Gly Leu Thr Pro Lys Tyr Ile Asp Ile Pro Glu Leu Val

275 280 285

Ala Asn Val Lys Phe Glu Ala Lys Pro Ala Asn Gln Leu Leu Thr Gln

290 295 300

Pro Val Lys Gln Gly Ala Glu Leu Asp Phe Pro Ile Pro Val Asp Asp

305 310 315 320

Phe Ala Phe Ser Leu His Asp Leu Ser Asp Lys Glu Thr Thr Ile Ser

325 330 335

Gln Gln Ser Ala Ala Ile Leu Phe Cys Val Glu Gly Asp Ala Thr Leu

340 345 350

Trp Lys Gly Ser Gln Gln Leu Gln Leu Lys Pro Gly Glu Ser Ala Phe

355 360 365

Ile Ala Ala Asn Glu Ser Pro Val Thr Val Lys Gly His Gly Arg Leu

370 375 380

Ala Arg Val Tyr Asn Lys Leu

385 390