黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记及其应用

摘要

本发明公开了黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记及其应用。黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记Indel‑16Y‑46，其上游引物:SEQ ID NO.1,下游引物:SEQ ID NO.2。本发明所述的分子标记在全雌强单性结实黄瓜新品种分子标记辅助育种中的应用。利用本发明分子标记对Parth2.1位点选择效率为100％。基于该分子标记开发了一种全雌强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，获得的全雌强单性结实的黄瓜新品种是欧洲温室型黄瓜自交系品种，有较高的产量和优良的果实品质，可直接作为改良其他品种单性结实性和全雌性的骨干亲本。

说明书

技术领域

本发明公开了黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记及其应用，属于蔬菜分子遗传育种技术领域，可用于黄瓜单性结实分子标记辅助育种。

背景技术

黄瓜是我国大面积栽培的主要蔬菜之一，具有极高的社会价值和经济效益。单性结实是指子房不经过授粉受精或别的刺激而发育成果实的现象。单性结实能力强的黄瓜品种，具有显著的增产潜力，一般可提高产量20％以上，且单性结实的果实因无籽，瓜瓤少，果肉厚，使得品质得到提高，商品性好。因此，单性结实性是与黄瓜产量和品质密切相关的重要经济性状，是黄瓜品种选育的目标性状之一，在黄瓜育种中极具利用价值。

目前，黄瓜单性结实材料或品种的选育主要依靠田间束花隔离进行表型鉴定，该方法不仅耗时长，需要大量的人力和物力，且单性结实容易受外界条件的影响，表型选择效率不高，选育难度大，育成的黄瓜品种存在单性结实性不稳定，易受栽培环境影响等弊端。近年来，随着分子标记技术的发展，许多研究者利用与目标性状QTL连锁的分子标记对种质进行辅助选择，这一方法不受基因表达和环境因素的影响，可在早代进行选择且操作简单，很大程度上提高了选择的速度和准确性。其中InDel(Insertion/Deletion)分子标记是基于全基因组重测序开发的标记，因其在基因组内分布广、密度大、稳定性和多态率高，检测容易且具有共显性遗传，重复性好、对DNA质量要求较低等优点，可以高效准确地用于遗传图谱构建，利用与目标性状连锁的分子标记进行辅助育种。

基于上述目的，本发明通过黄瓜单性结实遗传机制和单性结实QTL定位研究。以强单性结实自交系‘EC1’为母本，非单性结实自交系‘8419s-1’为父本，构建了F_2:3群体和F_4:5剩余杂合体群体(RHL，Residual>2:3群体对黄瓜单性结实主效QTL位点Parth2.1进行定位(Zhe>

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的全雌强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法。

本发明的目的通过以下方案实现：

黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记Indel-16Y-46，该分子标记的引物序列为：上游引物:SEQ ID NO.1,下游引物:SEQ ID NO.2，Indel-16Y-46是Parth2.1精细定位区间内(物理距离181kb)的峰值标记。

一种黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的分子标记方法，以待选择材料的DNA作为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-16Y-46的引物对进行PCR扩增；对扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析；能扩增出105bp特异条带的植株为含有黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的植株。

所述的分子标记方法优选包括：

(1)以待鉴定材料的DNA为模板，用权利要求1所述的分子标记Indel-16Y-46的引物对进行PCR扩增；PCR扩增反应的总体系为20μl，包括：10×buffer(含Mg²⁺)2.0μL，dNTP2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL^-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH₂O，12.75μL，反应程序为94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min>

(2)标记引物鉴定Parth2.1：能扩增出105bp特异条带的植株为含有Parth2.1的植株。

本发明所述的分子标记在全雌强单性结实黄瓜新品种分子标记辅助育种中的应用。

一种全雌强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，包括以下步骤：

(1)以具有强单性结实性全雌的高代自交系EC1为母本，以无单性结实能力且弱雌性的高代自交系8419为父本，进行杂交得F1，杂种F1自交获得F2，并继续通过单粒传的方式构建F2:4群体，通过对开花当天的雌花进行套花处理，在处理7天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计单性结实果实的数量，单性结实果实的数量/单株套花的总体数量＝单性结实率，单性结实率超过90％即被认定为具有强单性结实能力；通过该方法从F2:4群体中筛选出强单性结实性的重组单株；

(2)回交及分子标记辅助选择

分别利用与单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的InDel标记InDel-16Y-46和与全雌性状连锁的分子标记SA166，从上述筛选出的高单性结实率的单株中进行基因型筛选，选取InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株，具体方法如下：

1)提取单株材料叶片的DNA作为模板，用InDel-16Y-46和SA166分子标记引物进行PCR扩增；

2)PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色；

3)结果判断InDel标记InDel-16Y-46在无单性结实性的黄瓜材料中扩增出135bp大小的单一条带，而在强单性结实黄瓜材料中扩增出105bp大小的单一条带，在强单性结实黄瓜材料与无单性结实性的黄瓜材料杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出105bp和135bp的两条带,SA166标记在全雌黄瓜材料或其他全雌单株中，可以扩增出166bp的条带，而在非全雌的材料中无条带扩出；所述的InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株能同时扩增出105bp、135bp和166bp条带；

所述的与单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记InDel-16Y-46，其上游引物:SEQ ID NO.1,下游引物:SEQ ID NO.2；分子标记SA166，其上游引物:SEQ ID NO.3,下游引物:SEQ ID NO.4；

(3)选择步骤(2)筛选到的InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株中单性结实率>90％的重组单株与8419进行回交，在回交1代中继续选择InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株，与8419进行回交；在回交2代后，继续选择InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株进行自交，最后获得InDel-16Y-46和SA166基因型与EC1带型一致，而其他染色体区段为8419带型的单株即为全雌强单性结实的黄瓜新品种。

所述的全雌强单性结实的黄瓜新品种基本具有欧洲温室型黄瓜8419性状，并单性结实率>90％，且为全雌自交系。

所述的所述的全雌强单性结实的黄瓜新品种，植株长势强，节间长10-12厘米，茎粗0.7-0.8厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在2-3节，每节均为一朵雌花，无雄花，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长12-15厘米，粗3-4厘米，主侧蔓均可结瓜。

有益效果：

(1)本发明通过进一步的回交群体构建，利用BC3S1群体完成了Parth2.1的精细定位，同时结合双亲重测序结果的分析，开发并筛选与主效QTL位点紧密连锁的InDel标记InDel-16Y-46，该标记引物序列是根据双亲基因组重测序的结果设计而成，利用本发明中与单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记InDel-16Y-46，在F2:4群体中30个强单性结实单株和15个无单性结实性单株中的Parth2.1位点选择效率为100％，这个分子标记可作为鉴定基于EC1强单性结实品种的连锁标记，提高育种效率。

(2)本发明基于黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记Indel-16Y-46，开发了一种全雌强单性结实黄瓜新品种的分子标记辅助育种方法，按照该方法获得的全雌强单性结实的黄瓜新品种是欧洲温室型黄瓜自交系品种，有较高的产量和优良的果实品质，可直接作为改良其他品种单性结实性和全雌性的骨干亲本。

附图说明

图1：单性结实主效QTL Parth2.1的精细定位

图2：用双亲、杂交F1、强单性结实纯合/杂合单株和非单性结实单株DNA作为模板，用本发明中的InDel-16Y-46标记引物进行PCR扩增电泳图结果显示在EC1(泳道3)和强单性结实自交系(泳道6-14)中扩增出105bp的单条带，强单性结实杂合单株中(15-35)扩增出105bp和135bp的条带；而在非单性结实亲本(泳道4)和自交系(泳道36-50)中均扩增出135条带。

注：从左至右泳道依次为泳道1～泳道50；泳道1，2：Marker；泳道3：.EC1；泳道4：8419s-1；泳道5：F1；泳道6-14：强单性结实自交系；泳道15-35：强单性结实杂合单株；36-50：非单性结实自交系

图3：全雌强单性结实新品种Parth139的田间表现

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

举例说明本发明的具体实施过程，使本领域技术人员按照其不需要创造性劳动就能完成该发明即可，实施例的限定不能作为限定发明人保护范围的局限。

实施例1：Parth2.1连锁分子标记开发及其在F2:4群体中的分子检测

1、单性结实主效QTL Parth2.1的精细定位及峰值标记开发

以强单性结实自交系‘EC1’为母本，非单性结实自交系‘8419s-1’为父本构建了F2分离群体，完成了单性结实主效QTL Parth2.1的初步定位(Zhe Wu,Ting Zhang,Lei Li,Jian Xu,Xiaodong Qin,Tinglin Zhang,Li Cui,Qunfeng Lou,Ji Li*and JinfengChen*.Identification of a stable major-effect QTL(Parth 2.1)controllingparthenocarpy in cucumber and associated candidate gene analysis via wholegenome re-sequencing[J].BMC plant biology,2016,16,182)，在此基础上，从F2群体中选择携带Parth2.1且单性结实率大于90％的单株#68作为供体亲本，以非单性结实材料8419s-1为轮回亲本进行回交，每代回交均以初定位标记为选择标记对Parth2.1位点进行选择，回交三代后在BC3群体中筛选单性结实率大于90％的单株进行自交，构建BC3S1群体，对群体中每个单株开花当天的雌花进行套花处理，在处理7天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计BC3S1群体中每个单株的单性结实果实数量，计算单性结实率(单性结实果实的数量/单株套花的总体数量)；通过基因组重测序在parth2.1初定位区间内开发了165对Indel分子标记，利用这些标记和群体单性结实率统计结果，在BC3S1群体上完成了Parth2.1的精细定位，将定位区间缩小至物理距离为181kb，其中InDel-16Y-46为精细定位区间的峰值标记(图1)。

2、InDel-16Y-46在F2:4群体中的分子检测

已单性结实亲本EC1、非单性结实亲本8419s-1、EC1与8418s-1的杂交F1以及在F2：4群体中的强单性结实和非单性结实结实单株为分子检测对象，以InDel-16Y-46标记引物进行PCR检测。

PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg2+)2.0μL，dNTP 2.0μL，正、反向引物各1μL，Taq酶(5U·μL-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH2O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min 20s，35个循环；72℃延伸5min，10℃保存。PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。

结果表明：结果显示在EC1和强单性结实自交系中扩增出105bp的单条带，强单性结实杂合单株中扩增出105bp和135bp的条带；而在非单性结实亲本和自交系中均扩增出135条带(图2)。InDel-16Y-46对Parth2.1的选择效率为100％。

实施例2：全雌强单性结实黄瓜品种Parth139的培育及应用，包括：

1、亲本性状

(1)全雌、强单性结实性状供体亲本EC1

EC1(Zhe Wu,Ting Zhang,Lei Li,Jian Xu,Xiaodong Qin,Tinglin Zhang,LiCui,Qunfeng Lou,Ji Li and Jinfeng Chen.Identification of a stable major-effect QTL(Parth 2.1)controlling parthenocarpy in cucumber and associatedcandidate gene analysis via whole genome re-sequencing[J].BMC plant biology,2016,16,182)是全雌强单性结实欧洲温室型黄瓜自交系材料，其植株长势强，侧枝发达，主侧枝结果，商品果形状为短棒形，单性结实率超过90％。

(2)弱雌、非单性结实亲本8419

8419(武喆,李蕾,张婷,张停林,李季,&娄群峰等.(2015).黄瓜单性结实性状的qtl定位.中国农业科学,48(1),112-119.)是弱雌、无单性结实能力的欧洲温室型黄瓜自交系材料，其植株长势强，侧枝发达，主蔓结果，商品果为短棒形，果色油绿。

2、强单性结实性和全雌性的转育与选择过程：

(1)性状转育

将EC1和8419同时进行浸种、催芽、播种、定植及正常的植株管理。

在EC1长到3叶1心是用300mg/L的硝酸银溶液诱雄1次，隔一周再诱雄1次。

在开花期，以8419为母本，以EC1为父本，进行杂交得F1，具体操作为：在授粉前一天下午，选择花瓣全黄但花蕾未张开的8419雌花花蕾和EC1雄花花蕾进行夹花，防止串粉；开花当天上午当大棚温度升至25度，植株叶缘逐渐出现吐水时，将EC1的雄花花粉授到8419的雌花柱头上，3朵雄花授一朵雌花，并继续对授粉后的雌花夹花隔离三天。

杂种F1自交获得F2，并继续通过单粒传的方式构建了一套含有115个株系的F2:4群体。通过对开花当天的雌花进行套花处理，在处理7天后观察子房是否膨大，如果子房膨大即认定为单性结实果实，统计单性结实果实的数量，单性结实果实的数量/单株套花的总体数量＝单性结实率，单性结实率超过90％即被认定为具有强单性结实能力。通过该方法从F2:4群体中筛选出全雌、单性结实率高的单株。

(2)回交及分子标记辅助选择

分别利用与单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的InDel标记InDel-16Y-46和与全雌性状连锁标记SA166，对上述性状鉴定为全雌高单性结实率的单株进行基因型筛选，选取InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株，具体实验步骤如下：

1)提取单株材料叶片的DNA作为模板，用InDel-16Y-46和SA166分子标记引物进行PCR扩增；

2)PCR扩增反应体系组成为：10×buffer(含Mg²⁺)2.0μL，dNTP>-1)0.25μL、DNA(10ng)1.0μL，ddH₂O，12.75μL，反应总体积为20μL。反应程序为94℃预变性5min，每个循环95℃预变性30s，60℃退火30S，72℃延伸1min>

3)PCR产物检测：反应产物在7％的非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色。

InDel标记InDel-16Y-46在无单性结实性的黄瓜材料中，例如8419或群体中无单性结实性单株，扩增出相同的135bp大小的单一条带，而在强单性结实EC1中扩增出105bp大小的单一条带，在EC1与8419杂交F1或者群体中强单性结实性的杂合单株中可以扩出105bp和135bp的两条带。SA166标记在全雌黄瓜材料EC1或其他全雌单株中，可以扩增出166bp的条带，而在非全雌的材料中无条带扩出。所述的InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株能同时扩增出105bp、135bp和166bp条带；

所述的与单性结实主效QTL Parth2.1紧密连锁的分子标记InDel-16Y-46，其上游引物序列为AGTGCACTTCGTTTTGAACATCAT(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为AGGCAGGACAACCATGAATAAAAA(SEQ ID NO.2)；与黄瓜全雌性连锁的SA166标记，其上游引物序列为CAAAATGTCCTATGACTGGTAA(SEQ ID NO.3)，下游引物序列为CATATTGATCACAATGTTCTTAAA(SEQ ID NO.4)。

选择其中高单性结实率且符合上述基因型的重组单株与8419进行回交，在回交1代中继续选择InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株，与8419进行回交；在回交2代后，继续选择InDel-16Y-46和SA166均为杂合的单株进行自交，最后获得InDel-16Y-46和SA166基因型与EC1带型一致，而其他染色体区段为8419带型的单株即为全雌强单性结实的黄瓜新品种。

3、全雌强单性结实的黄瓜新品种Parth139具有以下特性：

Parth139基本具有欧洲温室型黄瓜8419性状，并具有强单性结实能力，且为全雌自交系；

所述的所述的全雌强单性结实的黄瓜新品种，植株长势强，节间长10-12厘米，茎粗0.7-0.8厘米，叶片绿色，平均最大叶片面积为23×22厘米，第一雌花节位在2-3节，每节均为一朵雌花，无雄花，商品瓜为线形，绿色，瓜刺白色，数量较多，平均瓜长12-15厘米，粗3-4厘米，主侧蔓均可结瓜。

4、全雌强单性结实的黄瓜新品种Parth139应用：

将Parth139与配合力高的普通栽培黄瓜按3：1种植，并进行正常的植株管理。在开花期进行隔离，然后以Parth139为母本，普通栽培黄瓜为父本进行人工授粉。采收Parth139植株上的成熟果实，剖瓜洗种，将种子晾晒烘干，即得到全雌强单性结实的杂种一代种子。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 黄瓜单性结实主效QTL Parth2.1的连锁分子标记及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgcacttc gttttgaaca tcat 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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