羊肌内脂肪含量分子标记及其在肉羊品种培育中应用

摘要

本申请提供了检测羊CAPN1上C724A和CAPN2上A601G多态性基因型位点来预测羊肌内脂肪含量的方法，并提供了这种方法在肉羊品种培育中的应用。

说明书

技术领域

本申请属于分子生物学和畜牧业肉羊品种培育领域，具体地，本申请提供了检测羊CAPN1上C724A和CAPN2上A601G多态性基因型位点来预测羊肌内脂肪含量的方法，并提供了这种方法在肉羊品种培育中的应用。

背景技术

肌内脂肪（IMF）是羊肉肌肉风味的主要指标之一，在正常范围内，肌内脂肪含量与羊肉的鲜嫩度、口感风味和多汁性呈现直接正相关的关系：肌纤维之间沉积一定量脂肪时，大理石纹增加，肉质鲜嫩性和多汁性得到改善（Gerbens F等，Assoeiations of heart andadipoeyte fatty acid-binding protein gene expression with intramuscular fatcontent in pigs，AnimSei，2001，79：347-354）。之前的研究表明，遗传上肌内脂肪含量与瘦肉率呈现负相关的关联，因此，培育高瘦肉率同时高机内脂肪含量（即肉质口感良好）的羊品种理论上完全可行。但羊，特别是具体品种羊的肌内脂肪含量分子标记的筛选工作目前开展尚不多。

美利奴羊是是细毛绵羊品种的统称，在世界各地广泛饲养培育多年后衍生出了诸多毛用、毛肉兼用、肉毛兼用的品种。德国美利奴羊是我国自50年代起就开始引进养殖的优秀肉毛兼用品种，其在生长周期、繁殖性能、适应性、产肉性能上均有良好的表现，养殖实践中也已经与多种细毛杂种羊和本地羊尝试杂交以进一步改善其品种。针对德国美利奴羊肉质上的不足，使用分子标记高效筛选优良肉质个体用于繁殖和育种，是进一步改善德国美利奴羊品种的高效途径。

发明内容

针对我国常见的德国美利奴羊品种，申请人从现有技术出发，在CAPN基因上寻找与羊肌内脂肪含量相关的多态性位点，在寻找到/现有技术中检索到的15个多态性位点中，发现了CAPN1和CAPN2上的两个多态性位点C724A和A601G与羊肉肌内脂肪明显相关。这两个分子标记可以作为培育优质肉用/肉毛德国美利奴羊品种时的参考依据。

一方面，本申请提供了检测CAPN1和/或CAPN2基因多态性的试剂在羊品种培育中的应用。

进一步地，所述羊为德国美利奴羊。

进一步地，所述CAPN1和/或CAPN2基因多态性为CAPN1上的C724A和CAPN2上的A601G。

进一步地，所述试剂为PCR检测方法所用试剂。

进一步地，所述试剂为序列为SEQ ID NO.5-8的引物和测序用试剂。

进一步地，所述应用为选择CAPN1 724位置上基因型为CA或AA和CAPN2 601位置上基因型为AG或GG的羊用于品种培育。

另一方面，本申请提供了一种用于分子标记辅助羊品种培育的试剂盒，包括检测CAPN1和/或CAPN2基因多态性的试剂。

进一步地，所述CAPN1和/或CAPN2基因多态性为CAPN1上的C724A和CAPN2上的A601G。

进一步地，所述试剂为PCR检测方法所用试剂。

进一步地，所述试剂为序列为SEQ ID NO. 5-8的引物和测序用试剂。

本申请的方法和试剂盒可用于各种肉羊或肉毛兼用、毛肉兼用羊，包括但不限于各种美利奴羊、小尾寒羊、杜泊羊、萨福克羊、湖羊、夏洛莱羊、波尔山羊、黄羊、大耳羊、努比亚山羊等。

本申请的方法和试剂盒可与其他分子生物学品种培育方法或传统品种培育方法联合使用。

本申请的方法和试剂盒筛选出的种羊可用于自然交配和人工授精的品种培育方法。

本申请的方法和试剂盒中检测多态性的试剂可以是基于PCR的检测方法，基于荧光能量共振的检测方法、基于质谱的检测方法、DNA芯片方法等中所用的试剂。

具体实施方式

实施例1 德国美利奴羊中CAPN1和CAPN2（钙蛋白酶1和钙蛋白酶2）多态性位点的发现

CAPN是一种细胞内普遍存在的巯基丙氨酸蛋白内切酶，现有研究表明，CAPN，特别是CAPN1在某些牛和羊种类中与肉嫩化过程相关，申请人以此为基础，研究了德国美利奴羊中的CAPN多态性及其与肌内脂肪的关联。

实验对象选择申请人自有养殖场内的健康、成年纯种德国美利奴羊355只，屠宰前颈静脉采血5mL加入含抗凝剂而的离心管中保存于-20摄氏度下，屠宰后取背最长肌肉样-80摄氏度下保存。

肌内脂肪含量测定使用索氏抽提法，检测羊背最长肌肉样的肌内脂肪含量：（1）将3-5g样品在液氮中研至细粉，装入称重过的烘干滤纸包中，称重含湿样的滤纸包，干燥2h后，称重含干样的滤纸包；（2）使用索氏抽提器室温下乙醚抽提6h；（3）乙醚挥发后，将滤纸包干燥2h后称重。按照：（含干样滤纸包重-抽提后干燥滤纸包重）/（含湿样滤纸包重-滤纸包干重）计算肌内脂肪含量百分数。

分子生物学实验部分委托北京微阅基因技术有限公司进行：

使用酚-氯仿法提取血液样品DNA，琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度后保存于-20摄氏度下。

根据Genbank上绵羊CAPN1和CAPN2的序列信息（NM_001127267和NM_001112817，见本申请SEQ ID NO.1-4）使用Primer Premier 5.1设计引物扩增，并进行PCR-SSCP分析，发现CAPN1上C724A（Leu-Met，均为非极性氨基酸）和CAPN2上A601G（Thr-Ala，由极性氨基酸变为非极性氨基酸）两个与肌内脂肪相关的多态性位点。

实施例2 多态性位点的基因型频率和等位基因频率

CAPN1上C724A和CAPN2上A601G在实验用德国美利奴羊群（355只）中的基因型频率和等位基因频率见下表：

表1：CAPN1上C724A和CAPN2上A601G的基因型频率和等位基因频率

经过卡方检验，实验用德国美利奴羊群在两个多态性位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态（P>0.05）。CAPN1上C724A属于低度多态性位点，CAPN2上A601G属于中度多态性位点。

实施例3不同基因型与肌内脂肪含量的关联

使用实施例1中所述的方法检测各肉样肌内脂肪含量，各基因型与肌内脂肪含量的关联如下表所示：

表2：不同基因型与肌内脂肪（背最长肌）含量的关联

从上表数据可见，两个位点背最长肌肌内脂肪含量最小二乘均值的关系为CC<CA<AA，AA<AG<GG，CAPN1 724位置处AA与CC，CA与CC之间差异均极显著（P<0.01），CAPN2 601位置处GG与AA之间差异极显著（P<0.01），而AG与AA之间差异不显著（P=0.166）。两个多态性位点均有较好的作为品种培育分子标记的潜力。

实施例4 多态性分子标记用于德国美利奴羊品种培育实践

确定多态性位点后，将种羊颈静脉采血样本送至北京微阅基因技术有限公司，以SEQID NO.5-8的引物扩增后测序检测CAPN1上C724A和CAPN2上A601G处基因型。以基因型为标准选取CAPN1 724位置上基因型为AA和CAPN2 601位置上基因型为GG的种公羊3只，母羊25只，CAPN1 724位置上基因型为CA和CAPN2 601位置上基因型为GG的种公羊4只，将上述公羊和母羊用于自然交配繁殖。截止到本申请申请日前，统计6月龄时8样本中背最长肌和臀大肌中肌内脂肪，平均值为9.67%±0.31%，5.75%±0.25%，从经验上看，超过申请人之前所养德国美利奴羊同期水平约1.6和0.7个百分点，口感得到了一定提升，同时体重、羊毛等性状无显著变化。虽然尚未得到完全成年后的肌内脂肪数据，但本申请分子标记辅助选择的实践效果也已经较为明确。

序列表

<110> 刘学峰

<120> 羊肌内脂肪含量分子标记及其在肉羊品种培育中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 716

<212> PRT

<213> sheep

<400> 1

Met Ala Glu Glu Phe Ile Thr Pro Val Tyr Cys Thr Gly Val Ser Ala

1 5 1015

Gln Val Gln Lys Gln Arg Ala Lys Glu Leu Gly Leu Gly Arg His Glu

202530

Asn Ala Ile Lys Tyr Leu Gly Gln Asp Tyr Glu Gln Leu Arg Val His

354045

Cys Leu Gln Arg Gly Ala Leu Phe Arg Asp Glu Ala Phe Pro Pro Val

505560

Pro Gln Ser Leu Gly Phe Lys Glu Leu Gly Pro Asn Ser Ser Lys Thr

65707580

Tyr Gly Ile Lys Trp Lys Arg Pro Thr Glu Leu Phe Ser Asn Pro Gln

859095

Phe Ile Val Asp Gly Ala Thr Arg Thr Asp Ile Cys Gln Gly Ala Leu

100 105 110

Gly Ala Cys Trp Leu Leu Ala Ala Ile Ala Ser Leu Thr Leu Asn Asp

115 120 125

Thr Leu Leu His Arg Val Val Pro His Gly Gln Ser Phe Gln Asp Gly

130 135 140

Tyr Ala Gly Ile Phe His Phe Gln Leu Trp Gln Phe Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Val Val Val Asp Asp Leu Leu Pro Thr Lys Asp Gly Lys Leu Val

165 170 175

Phe Val His Ser Ala Gln Gly Asn Glu Phe Trp Ser Ala Leu Leu Glu

180 185 190

Lys Ala Tyr Ala Lys Val Asn Gly Ser Tyr Glu Ala Leu Ser Gly Gly

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Ser Thr Ser Glu Gly Phe Glu Asp Phe Thr Gly Gly Val Thr Glu Trp

210 215 220

Tyr Glu Leu Arg Lys Ala Pro Ser Asp Leu Tyr Asn Ile Ile Leu Lys

225 230 235 240

Ala Leu Glu Arg Gly Ser Leu Leu Gly Cys Ser Ile Asp Ile Ser Ser

245 250 255

Ile Leu Asp Met Glu Ala Val Thr Phe Lys Lys Leu Val Lys Gly His

260 265 270

Ala Tyr Ser Val Thr Gly Ala Lys Gln Val Asn Tyr Gln Gly Gln Met

275 280 285

Val Asn Leu Ile Arg Met Arg Asn Pro Trp Gly Glu Val Glu Trp Thr

290 295 300

Gly Ala Trp Ser Asp Gly Ser Ser Glu Trp Asn Gly Val Asp Pro Tyr

305 310 315 320

Val Arg Glu Gln Leu Arg Ile Lys Met Glu Asp Gly Glu Phe Trp Met

325 330 335

Ser Phe Arg Asp Phe Met Arg Glu Phe Thr Arg Leu Glu Ile Cys Asn

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Thr Leu Tyr Glu Gly Thr Trp Arg Arg Gly Ser Thr Ala Gly Gly Cys

370 375 380

Arg Asn Tyr Pro Ala Thr Phe Trp Val Asn Pro Gln Phe Lys Ile Arg

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Leu Glu Glu Thr Asp Asp Pro Asp Pro Asp Asp Tyr Gly Gly Arg Glu

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Ser Gly Cys Ser Phe Leu Leu Ala Leu Met Gln Lys His Arg Arg Arg

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Glu Arg Arg Phe Gly Arg Asp Met Glu Thr Ile Gly Phe Ala Val Tyr

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Glu Val Pro Pro Glu Leu Val Gly Gln Pro Ala Val His Leu Lys Arg

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Asp Phe Phe Leu Ala Asn Ala Ser Arg Ala Arg Ser Glu Gln Phe Ile

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Asn Leu Arg Glu Val Ser Thr Arg Phe Arg Leu Pro Pro Gly Glu Tyr

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Val Val Val Pro Ser Thr Phe Glu Pro Asn Lys Glu Gly Asp Phe Val

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Leu Arg Phe Phe Ser Glu Lys Ser Ala Gly Thr Gln Glu Leu Asp Asp

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Gln Val Gln Ala Asn Leu Pro Asp Glu Gln Val Leu Ser Glu Glu Glu

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Ile Asp Glu Asn Phe Lys Ser Leu Phe Arg Gln Leu Ala Gly Glu Asp

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Met Glu Ile Ser Val Lys Glu Leu Arg Thr Ile Leu Asn Arg Ile Ile

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Ser Lys His Lys Asp Leu Arg Thr Thr Gly Phe Ser Val Glu Ser Cys

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Arg Ser Met Val Asn Leu Met Asp Arg Asp Gly Asn Gly Lys Leu Gly

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Ile Phe Arg Lys Phe Asp Leu Asp Lys Ser Gly Ser Met Ser Ala Tyr

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Glu Met Arg Met Ala Ile Glu Phe Ala Gly Phe Lys Leu Asn Lys Lys

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Leu Tyr Glu Leu Ile Ile Thr Arg Tyr Ser Glu Pro Asp Leu Ala Val

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Asp Phe Asp Asn Phe Val Cys Cys Leu Val Arg Leu Glu Thr Met Phe

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Arg Phe Phe Lys Thr Leu Asp Thr Asp Leu Asp Gly Val Val Thr Phe

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<210> 2

<211> 2151

<212> DNA

<213> sheep

<400> 2

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gattacgagc agctgcgggt tcactgcctg caaagggggg cccttttccg tgatgaggct 180

ttccccccag tgccccagag cctgggcttc aaggagctgg gccccaactc ctccaaaacc 240

tatggcatca agtggaagcg tcccacggag ctgttctcaa acccccagtt catcgtggat 300

ggagccaccc gcacagacat ctgccagggc gcactggggg catgttggct tctggctgcc 360

atcgcctccc ttaccctcaa tgacacgctc ctgcaccgag tagttccaca tggacaaagc 420

ttccaggatg gctacgcggg catcttccat ttccagctgt ggcagtttgg tgagtgggtg 480

gatgtggtgg tggatgacct gctgcccacc aaggacggga agctggtgtt cgtgcactct 540

gcccaaggca acgagttctg gagcgccctg ctggagaagg cctatgccaa ggtgaacggc 600

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gtcaccgagt ggtatgaact gcggaaggcg cccagcgacc tctacaacat catcctcaag 720

gccctggagc gcggctccct gctgggctgc tccatcgata tctccagcat tctggacatg 780

gaggctgtca ccttcaagaa gctggtgaag ggtcacgcct actctgtgac tggggccaag 840

caggtgaact accagggcca gatggtgaac ctgatccgga tgcggaaccc ctggggcgag 900

gtggaatgga cgggagcctg gagtgacggc tcctcggagt ggaacggcgt ggacccttac 960

gtgcgggagc agctccggat caagatggag gatggggagt tctggatgtc attccgagac 1020

ttcatgcgtg aattcacccg cctggagatc tgcaacctga cgcctgacgc actcaagagc 1080

cagaggttcc gcaactggaa caccaccctg tacgagggca cctggcggcg ggggagcacc 1140

gcggggggct gccgcaacta cccagccact ttctgggtga acccccagtt caagatccgg 1200

ctggaggaga cggatgaccc agaccccgac gactacgggg gtcgcgagtc aggctgcagc 1260

ttcttgctcg ccctcatgca gaagcaccgc cgtcgagagc gccgattcgg ccgtgacatg 1320

gagaccatag gtttcgctgt ctacgaggtc cctccggagc tggtgggcca gccggccgtg 1380

catctgaagc gagacttctt cctggccaat gcctcccggg cccggtctga gcagttcatc 1440

aacctgcggg aggtcagcac ccgcttccgc ctgccgcccg gggagtacgt ggtggtgccc 1500

tctaccttcg agcccaacaa ggaaggcgac tttgtgctgc gtttcttctc agagaagagc 1560

gcagggaccc aagagctgga tgaccaggtc caggccaatc tccctgatga gcaagtgctc 1620

tcagaagagg agattgatga gaacttcaag tctctcttca gacaactggc aggggaggac 1680

atggagatca gcgtcaagga gctgcggacc atcctcaaca ggatcatcag caaacacaaa 1740

gacctgcgga ccacgggctt cagcgtggag tcctgccgca gcatggtcaa cctcatggat 1800

cgcgacggca atggcaaact gggcctggtg gagttcaaca tcctatggaa ccggatccgg 1860

aattacctgt ccatcttccg gaagtttgac ctggacaagt cgggcagcat gagtgcctac 1920

gagatgcgga tggccattga gtttgcaggc ttcaagctca acaagaagct gtacgagctc 1980

attatcaccc gctactcgga gccagacctg gccgtggact tcgacaactt tgtgtgctgc 2040

ctggtgcggc tggagaccat gttccggttt ttcaaaactc tggacaccga tctggatgga 2100

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