一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法，人工改造的Bt‑cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt‑cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt‑cry3Bb基因山新杨植株。本发明得到的转Bt基因山新杨对柳蓝叶甲幼虫和成虫都是高致死的，由此获得了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt‑cry3Bb基因杨树新品种。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：

杨树(Populus L.)是杨属的植物，全属有约100多种，是世界上分布最广、适应性最强的树种。我国约62种(包括6杂交种)，其中分布中国的有57种，引入栽培的约4种，此外还有很多变种、变型和引种的品系。在中国分布范围跨北纬25°～53°，东经76°～134°，遍及东北、西北、华北和西南等地。

杨树是一种重要的经济林木和模式木本植物。杨树因速生丰产、实用性强、分布广、无性繁殖能力强，且基因组较小而成为研究林木生理和利用基因工程方法进行遗传改良的理想模式植物。杨树也是一种重要的可再生资源，杨木的用途很广。另外，杨树对环境保护也很重要，包括土地重新造林和污染土壤植物修复。

我国是世界上木材及木制品的生产大国，同时也是一个消费大国。人均占有森林资源很少的国家，1998年实施了天然林保护工程，使得我国木材供需矛盾更加突出。所以，种植杨树，不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。现我国已成为世界上杨树人工林面积最大的国家。对于我国来说，大力发展转基因杨树具有重大的意义，但由于杨树具有生长周期长、树体高大等特点以及杨树人工林容易发生大规模的虫害，而导致杨树发生虫害的害虫大多数是食叶类的害虫。危害杨树的鞘翅目害虫合计7科34种，以天牛科种类最为丰富，其中光肩星天牛、桑天牛、桃红颈天牛危害最为严重，金龟子、象甲科危害次之，而柳蓝叶甲对杨树叶片的危害也较严重，尤其对1年龄之内的杨树危害更大，极大地限制了杨树传统育种和栽培工作的开展。利用基因工程技术培育抗虫杨树品种已成为研究的热点之一。为了解决我国林木短缺，加快人工林的发展，急需进行优良抗虫杨树品种的开发和利用，在2001年批准了2种转Bt杨树可以进行商业化种植，分别是转Bt-cry1A基因的黑杨(Populusnigra)和转Bt-cry1Ac基因和API(慈姑蛋白酶抑制剂)基因的741杨[P.alba(P.davidiana×P.simonii)×P.tomentosa]，使我国成为唯一批准转基因杨树商业化种植的国家，目前，已有近22个抗虫杨树品种获准进行小规模田间试验、环境释放或中试生产，出于对转基因商业化的慎重，我国没有再批准新的商业杨树品种

山新杨是一种优良的杨树品种，它以采自嫩江县高峰林场山杨为母本，父本新疆杨来源于乌鲁木齐，于1964年进行杂交组合，经20年栽培试验，表现良好，性状稳定。适应性强，抗逆性好，常用于防风固沙。树干通直，树皮光滑淡绿色，披白粉，20年生树皮尚未开裂，果序自然脱落且不飞絮。

近年来，质体基因转化技术成为植物基因工程研究的热点之一，质体基因转化有诸多的优点，如：母系遗传、高效表达、无基因沉默、无位置效应、无基因污染等优点，而山新杨的繁殖是无性繁殖：不飞絮等特点，使其质体转基因更安全。用质体转基因技术转抗虫基因到杨树质体中，既能够达到相应的抗虫效果，又增加了生物安全性。

综上所述，现有技术存在的问题是：

现有技术中，杨树对柳蓝叶甲幼虫和成虫的高致死的效果防范差。

在抗虫性能，核转Bt基因杨树比质体转Bt基因杨树差，导致杨树利用短缺。

在基因的表达量方面，核转Bt基因杨树中Bt蛋白的表达量大多数较低，而且在杨树的各个组织中都有表达，在杨木中积累量较高。

核转Bt基因整合位点存在不确定性，容易造成位置效应。

在生物安全性方面，核转Bt基因杨树容易通过花粉使外源基因逃逸，农杆菌介导的转化容易造成带有Bt基因的农杆菌逃逸。

解决上述技术问题的难度：

目前所有的转Bt基因杨树均为核转基因，核转基因的缺点，如基因整合位点的不确定性、表达量不稳定和基因逃逸等，这些缺点目前较难克服。

解决上述技术问题的意义：

与核转基因相比，质体转基因较好的解决了这些问题，如定点整合到叶绿体基因组中；表达产物固定在叶绿体中；母系遗传方式，不会通过花粉传播外源基因；基因表达量大都较高。

本发明的这些优点使得质体转基因生物安全性更高。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法。

本发明是这样实现的，一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：

人工改造的Bt-cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；pYY26的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；

再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。

进一步，转Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体的构建方法包括：

以p3300-cry3Bb质粒DNA为模板，用cry3Bb-F5’GCGGCCGCTCAGAGCTGGACAGGGATGAACTC和cry3Bb-R5’CCATGGCCAACCCTAACAACAGGTC 3’这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry3Bb基因序列，PCR产物经PCR洁净试剂盒纯化后，与平末端载体-Blunt Simple连接后转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，再进行测序验证后，得到重组子pYY24；用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切pYY24质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，切取对应的凝胶上的小片段胶块，用凝胶回收试剂盒回收，把得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，进行测序验证正确的重组子命名为pYY26，即为Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体。

进一步，用基因枪法把pYY26质粒DNA导入山新杨基因组和抗性芽的筛选方法包括：

用0.6μm的金粉包裹pYY26质粒DNA，利用Bio-Rad基因枪轰击杨树叶片，基因枪参数：氦气压为1100psi，轰击距离9cm真空度28；筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μE·m^-2·s^-1。

进一步，转Bt-cry3Bb基因山新杨植株的获得和分子鉴定方法包括：

转Bt-cry3Bb基因山新杨抗性芽的初步鉴定：取在30mg/L壮观霉素PaSIM2上生长的抗性芽的叶片和常规培养的野生型山新杨叶片，以提取其叶片总DNA为模板，用JC-Pa-F5’GGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTGCAGTATTTG3’和JC-Pa-R5’CGGTACTTGTGATATTTCGGCTTG 3’这对引物，进行PCR检测；

转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Southern blot分析：提取经PCR初步验证转cry3Bb基因山新杨植株叶片和野生型山新杨植株叶片总DNA，用限制性内切酶Nde I将5μg山新杨野生型叶片总DNA和转基因山新杨叶片总DNA样品分别酶切后，经琼脂糖凝胶电泳后，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上；以杨树基因组DNA为模板，用psaB-prpbe-F5’TTAGCCAAAGGTGTACGTTCATGAG 3’和psaB-probe-R5’TTGCCCGGCTGGTTAAATGC 3’这对引物扩增得到的587bp的片段制备地高辛标记的psaB探针；

用金粉包裹pYY26质粒DNA，分别进行2次轰击后，得到转cry3Bb基因山新杨2个株系，再在30mg/L壮观霉素PaSIM1培养基上，经过3轮叶片再生后，经Southern blot分析后，得到2株转cry3Bb基因的山新杨植株。

进一步，转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Northern blot分析方法包括：设计cry3Bb基因探针引物cry3Bb-probe-F5’ATGGCCAACCCTAACAACAGGTC 3’和cry3Bb-probe-R5’TCGGCATGGAGTTCCTGAAGTG 3’；分别把100mg的山新杨野生型叶片和转cry3Bb基因山新杨叶片转入1.5mL装有小钢珠的离心管中，然后置于液氮中冷冻后，放入研磨仪中，研磨细后，用TriZol法提取总RNA；总RNA样品变性后，然后在1.0％的甲醛变性的琼脂糖凝胶中，恒压50伏特条件下电泳3-4小时，电泳结束后，把琼脂糖凝胶转移到带正电荷的尼龙膜上，利用毛细管作用，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上；以含有cry3Bb基因质粒为模板通过PCR扩增相应的基因片段作为探针序列，探针序列长度为553bp，用地高辛探针合成试剂盒标记并合成探针；RNA杂交温度42℃。

进一步，获得同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株后还需进行：质体转Bt-cry3Bb基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析；转Bt-cry3Bb基因山新杨抗虫性试验。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：

本发明在杨树的虫害一直是人们关注的问题，特别是对于鞘翅目类的害虫，影响树木的生长和林木的品质和生物安全性，而质体转基因解决了上述问题，通过质体转Bt-cry3类基因，只有在有光的条件下，整合到叶绿体基因组中Bt基因才会被开启，而在杨树根和木质部是没有叶绿体的，所以Bt基因不会在这两个部位表达。Bt基因主要在叶片叶绿体中表达，使Bt蛋白的积累区域化，不影响植物的正常生长，既提高了生物安全性又提高了林木的品质。

质体转Bt-cry3Bb基因杨树不但对柳蓝叶甲幼虫是100％致死率，而且对成虫的致死率也是100％，这是目前其他文献中所没有报道过的。

目前在国内外发表的文献和专利中未见有关于在杨树质体中进行转Bt基因的报道，本专利是世界上第一例在杨树质体中转Bt基因的报道，为杨树转Bt基因提供了一条新的途径，同时由于质体转基因的优越性，特别是生物安全性好，从而为杨树转基因新品种的商业化的重启奠定了坚实的基础。

本发明通过基因枪转化法把人工改造的Bt-cry3Bb基因导入山新杨叶绿体基因组中，通过壮观霉素筛选获得高抗柳蓝叶甲的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。首先，把人工改造的Bt-cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证和PCR验证后，再经测序进一步验证后，获得了Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体，命名为pYY26。再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过3轮叶片抗性再生后，获得两株同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株叶片喂食美国白蛾幼虫发现：喂食Bt转基因杨树叶片的柳蓝叶甲1龄幼虫，1天后致死率为100％；喂食Bt转基因杨树叶片的柳蓝叶甲3龄幼虫，12天后致死率为100％；喂食Bt转基因杨树叶片的柳蓝叶甲成虫，6天后致死率为100％。从而证明本发明的得到的转Bt基因山新杨对柳蓝叶甲幼虫和成虫都是高致死的，由此获得了一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt-cry3Bb基因杨树新品种。

在温室生长的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株和野生型山新杨植株在表型上没有明显差异，不影响植株的生长。从质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片对野外采集的柳蓝叶甲喂食试验来看：柳蓝叶甲3龄幼虫在喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片12天后全部死亡；柳蓝叶甲成虫在喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片6天后全部死亡。从质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片对人工饲养的柳蓝叶甲喂食试验来看：柳蓝叶甲1龄幼虫在喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片的，1天后全部死亡。从这两种喂食试验来看，质体转Bt-cry3Bb基因山新杨对植株叶片都起到了很好的保护。

从目前国内外发表的文献来看，质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株叶片的抗虫效果比核转基因杨树的抗虫效果要好一些。

从转基因杨树对柳蓝叶甲幼虫的致死情况来看，对于柳蓝叶甲1龄幼虫的致死率上看，质体转Bt-cry3Bb基因杨树的抗虫效果和核转Bt-cry3A基因杨树抗虫效果差不多，但从对柳蓝叶甲3龄幼虫的致死率上看，质体转Bt-cry3Bb基因杨树的抗虫效果比核转Bt-cry3A基因杨树抗虫效果要好一些。

表1 转Bt基因杨树抗虫性比较

从表1来看，核转Bt基因杨树和质体转Bt基因杨树对柳蓝叶甲1龄幼虫的致死率的致死率均为100％，对抗虫来说，仅从对1龄幼虫的抗虫不能完全说明其抗虫能力的强弱，要看对老一些的幼虫甚至是成虫的抗虫能力。质体转Bt基因杨树对3龄幼虫的抗虫效果比核转Bt基因杨树抗虫效果要强一些，甚至对成虫的致死率仍为100％。

本发明质体转Bt基因杨树具有生物安全性：

对于转基因生物安全评价和监管，国内和国外都建立了相应的评价体系、法律法规和监管机构。对于转Bt基因杨树除了关注自身的转化受体情况、转化用Bt基因种类的安全性、遗传方式和方法、Bt蛋白的表达量和杀虫效果、Bt蛋白在植物中的残留问题等，更多是关注基因流、基因的多效性和生态影响。对于本发明获得的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨而言，本发明使用的转化受体是山新杨，山新杨是不飞絮的杨树；转化方式是质体转化，质体遗传方式是母系遗传；基因整合方式是定点整合；在筛选基因aadA的两端引入了loxP序列，可以通过Cre-loxP重组酶系统把aadA基因消除掉，这些设计增加了转基因的安全性，特别是解决基因流的问题。目前，从核转Bt基因杨树的生态方面的研究来看，转Bt基因杨树也是安全的。而从生物安全性和抗虫效果来看，质体转Bt-cry3Bb基因山新杨对柳蓝叶甲幼虫和成虫的致死率均为100％，质体转Bt基因山新杨植株在表型上和野生型山新杨植株没有明显区别，所以质体转Bt基因杨树比核转Bt基因杨树更安全一些，对于Bt抗虫基因工程，最佳的效果是杀虫效果好，而且Bt蛋白的表达量要适量，减缓目标害虫对Bt蛋白抗性，转基因后不影响植物的正常生长，同时使用多种Bt基因或结合RNAi技术来抗虫。转基因植物对生态的影响是长期的，所以需要对转基因植物进行长期的观察研究，从而进一步确认其安全性，消除公众对转基因的担忧，以利于人们对转基因的认识、认可和接受，推动转基因植物的商业化进程。

附图说明

图1是本发明实施例提供的高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法流程图。

图2是本发明实施例提供的质粒pYY26构建图。

图3是本发明实施例提供的阳性芽的PCR检测图。

图中：泳道2、3、4和5检测cry3Bb基因是否导入细胞中(以基因特异性引物cry3Bb-F和cry3Bb-R这对引物扩增)；泳道6、7、8和9检测cry3Bb基因是否导入质体基因组中(以JC-Pa-F和JC-Pa-R这对引物扩增)。

图4是本发明实施例提供的质体转cry3Bb基因杨树质体基因组和分子鉴定图A：Nde I酶切杨树基因组图；B：Southern blot检测图；C：Northern blot检测图。

图5是本发明实施例提供的质体转cry3Bb基因杨树表型图。

图6是本发明实施例提供的质体转cry3Bb基因杨树叶片抗虫图A：测试虫为柳蓝叶甲1龄幼虫；B：测试虫为柳蓝叶甲3龄幼虫；C：测试虫为柳蓝叶甲成虫。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

现有技术中，杨树对柳蓝叶甲幼虫和成虫的高致死的效果防范差。

为解决上述技术问题，下面结合具体方案对本发明作详细描述。

如图1所示，本发明实施例提供的高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法包括：

S101:人工改造的Bt-cry3Bb基因克隆到山新杨质体转化载体pYY20上，经过酶切验证、PCR验证和测序验证后，获得了Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体pYY26；pYY26的氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

S102:再用金粉包裹pYY26质粒DNA通过基因枪转化法导入山新杨叶绿体基因组中，经壮观霉素筛选后获得多个抗性芽，经Southern blot检验得到的阳性抗性芽，在经过叶片抗性再生后，获得同质化的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株。

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。

实施例1

转Bt-cry3Bb基因山新杨质体转化载体的构建：

以p3300-cry3Bb质粒DNA为模板，用cry3Bb-F(5’GCGGCCGCTCAGAGCTGGACAGGGATGAACTC 3’SEQ ID NO：2)和cry3Bb-R(5’CCATGGCCAACCCTAACAACAGGTC 3’SEQ ID NO：3)这对引物，再用Pfu酶通过PCR扩增cry3Bb基因序列，PCR产物经PCR洁净试剂盒纯化后，与平末端载体-Blunt Simple连接后转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，送测序公司测序验证，经验证正确的重组子，命名为pYY24。用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切质粒pYY24DNA，经琼脂糖凝胶电泳后，切取对应的凝胶上的小片段胶块，用凝胶回收试剂盒回收，把得到的小片段与用限制性内切酶Nco I和Not I双酶切山新杨转化载体pYY20后得到的大片段连接，并转化大肠杆菌XL10-gold，把得到的重组子经PCR验证和酶切验证后，送测序公司测序验证，经验证正确的重组子命名为pYY26(带有cry3Bb基因)，即为cry3Bb基因山新杨质体转化载体，见图2。

实施例2

用基因枪法把pYY26质粒DNA导入山新杨基因组和抗性芽的筛选：

用0.6μm的金粉包裹pYY26质粒DNA，利用Bio-Rad基因枪(PDS-1000/He)轰击杨树叶片，基因枪参数：氦气压为1100psi，轰击距离9cm(阻拦网到平铺的叶片距离为9cm)，真空度28。具体操作按基因枪操作手册进行，并参照杨树质体基因枪转化方法进行。经基因枪轰击后的叶片材料切成3*3mm大小，远轴面朝上置于含30mg/L壮观霉素的PaSIM1筛选培养基上直至抗性芽出现，在此培养基上每隔1-2月换1次培养基。筛选培养条件为：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：20-25μE·m^-2·s^-1。

实施例3

转Bt-cry3Bb基因山新杨植株的获得和分子鉴定：

转Bt-cry3Bb基因山新杨抗性芽的初步鉴定：取在30mg/L壮观霉素PaSIM2上生长的抗性芽的叶片和常规培养的野生型山新杨叶片，以提取其叶片总DNA为模板，用JC-Pa-F(5’GGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTGCAGTATTTG3’SEQ ID NO：4)和JC-Pa-R(5’CGGTACTTGTGATATTTCGGCTTG 3’SEQ ID NO：5)这对引物，经PCR检测，结果发现：以负对照和野生型对照没有扩增到与该基因大小(1972bp)相似的条带，而转Bt-cry3Bb基因山新杨Pa-YY26#1株系和Pa-YY26#2株系均扩增到与该基因大小(1972bp)相似的条带，则说明该基因转入了山新杨细胞中；以负对照和野生型对照没有扩增到1449bp大小的条带，而转基因植株扩增到1449bp大小的条带，则说明这些cry3Bb基因整合到了叶绿体基因组中，见图3。

转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Southern blot分析：提取经PCR初步验证正确的转cry3Bb基因山新杨植株叶片和野生型山新杨植株叶片总DNA，用限制性内切酶Nde I将5μg山新杨野生型叶片总DNA和转基因山新杨叶片总DNA样品分别酶切后，经琼脂糖凝胶电泳后，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上；以杨树基因组DNA为模板，用psaB-prpbe-F(5’TTAGCCAAAGGTGTACGTTCATGAG 3’SEQ ID NO：6)和psaB-probe-R(5’TTGCCCGGCTGGTTAAATGC3’SEQ ID NO：7)这对引物扩增得到的587bp的片段制备地高辛标记的psaB探针，探针的标记和杂交按照罗氏地高辛试剂盒手册进行操作。结果发现：野生型杨树叶片杂交出3504bp大小的带，转cry3Bb基因山新杨Pa-YY26#1株系和转cry3Bb基因山新杨Pa-YY26#2株系，均同时杂交出3504bp大小的带和8888bp大小的带，说明抗性芽未达到同质化。用金粉包裹pYY26质粒DNA，分别进行2次轰击后，得到转cry3Bb基因山新杨2个株系，但是它们都没有达到同质化，再在30mg/L壮观霉素PaSIM1培养基上，经过3轮叶片再生后，经Southern blot分析后，发现它们均达到了同质化，见图4A、图4B，从而得到了2株质体转cry3Bb基因的山新杨植株(Pa-YY26#1和Pa-YY26#2)。

转cry3Bb基因山新杨抗性芽的Northern blot分析：设计cry3Bb基因探针引物cry3Bb-probe-F(5’ATGGCCAACCCTAACAACAGGTC 3’SEQ ID NO：8)和cry3Bb-probe-R(5’TCGGCATGGAGTTCCTGAAGTG 3’SEQ ID NO：9)。分别把大约100mg的山新杨野生型叶片和转cry3Bb基因山新杨叶片转入1.5mL装有小钢珠的离心管中，然后置于液氮中冷冻后，放入研磨仪中，研磨细后，用TriZol法提取其总RNA。适量的总RNA样品变性后，然后在1.0％的甲醛变性的琼脂糖凝胶中，恒压50伏特条件下电泳3-4小时，电泳结束后，把琼脂糖凝胶转移到带正电荷的尼龙膜上，利用毛细管作用，通过半干转移法把RNA转移到尼龙膜上。以含有cry3Bb基因的质粒为模板通过PCR扩增相应的基因片段作为探针序列，探针序列长度为553bp，用地高辛探针合成试剂盒标记并合成探针。RNA杂交温度是42℃。结果显示，cry3Bb基因在叶绿体中成功转录，见图4C。

cry3Bb基因序列为：

atggccaaccctaacaacaggtccgagcacgataccatcaaggtcacccctaactccgagctgcaaactaaccacaaccagtaccccctcgccgataacccgaacagcaccctggaagagctgaactacaaggagttcctcaggatgaccgaggattccagcactgaggtcctggacaactccaccgtcaaggatgccgtgggcaccggtatcagcgtcgtgggccagatcctcggcgtcgtgggtgtccctttcgccggcgcgctgacctccttctaccagtccttcctcaacactatctggcctagcgatgccgacccgtggaaggcgttcatggcccaggtcgaggtcctcatcgataagaagatcgaagagtacgccaagtccaaggcgctggccgagctgcaaggcctccagaacaacttcgaagattacgtcaacgccctcaactcctggaagaagacccctctgagcctccgctccaagcgctcccaggaccgcatccgcgagctgttcagccaggccgagtcccacttcaggaactccatgccgagcttcgcggtctccaagttcgaagtcctcttcctgccgacctacgcccaggccgcgaacacccacctcctgctcctgaaggatgcccaggtcttcggcgaggaatggggctactccagcgaggacgtcgcggagttctacaggcgccagctcaagctcacccagcagtacaccgaccactgcgtcaactggtacaacgtgggtctgaacggcctccgcggctccacttacgatgcctgggtcaagttcaacaggttccgccgcgagatgaccctcaccgtcctggatctcatcgtgctcttcccgttctacgacatcaggctgtactccaagggcgtcaagactgagctgacccgcgatattttcaccgaccctatcttcctcctcactaccctgcaaaagtacggcccgaccttcctctccatcgagaacagcatccgcaagcctcacctgttcgattacctccagggtatcgagttccacactcgcctccagccgggctacttcggtaaggattccttcaactactggtccggcaactacgtcgagaccaggcctagcatcggctcctccaagaccatcactagcccgttctacggtgataagtccaccgagcccgtccagaagctctccttcgatggccagaaggtctacaggaccatcgccaacactgacgtggcggcctggcctaacggcaaggtctacctcggtgtcaccaaggtggacttctcccagtacgatgaccagaagaacgagaccagcactcagacctacgattccaagcgcaacaacggccacgtctccgcccaggacagcatcgaccagctcccgcctgagaccactgacgaaccgctggagaaggcctactcccaccagctcaactacgcggagtgcttcctcatgcaggatcgccgcggcaccatcccgttcttcacctggactcaccgctccgtggacttcttcaacaccatcgatgccgagaagatcacccagctccctgtcgtgaaggcctacgcgctgtccagcggcgcctccatcatcgagggtcctggcttcaccggcggtaacctcctcttcctgaaggagtccagcaactccatcgccaagttcaaggtcaccctcaactccgctgccctgctccagcgctaccgcgtccgcatccgctacgccagcaccactaacctcaggctgttcgtccagaactccaacaacgatttcctcgtgatctacatcaacaagaccatgaacaaggacgacgacctcacctaccagactttcgatctggccaccaccaactccaacatgggcttcagcggtgacaagaacgagctgatcatcggcgccgaatccttcgtcagcaacgagaagatttacatcgataagatcgagttcatccctgtccagctctga SEQ IDNO：10。

地高辛标记的psaB探针序列为：

ttagccaaaggtgtacgttcatgagcccatgctaaagtttcaatcaattcctgccaatatccgcgccaggaaattaagaacataaatccagtagcccaaacaagatgtccaaataagaacatccatgcccagaccgataaactattcatcccaaaggggttatacccattgataagttgtgaagagtttaaccataaataatctcttaaccatcccatcaaataagtagaagattcattaaactgtgaaacgttaccctgccataatgttatgtgcttccaatgccaataaaaagtaacccatccaatggtatttaacatccagaaaaccgccaaataaaatgcgtcccaagccgaaatatcacaagtaccgcctcgtcccggaccatcgcaaggaaaactataaccaaaatcctttttatctggcattaacttagaaccacgcgcatctaaagcaccttttactaagatcaatgtagttgtatgtaaacctagagcaatagcatgatgaaccaagaagtctccaggccctattgttaagaataatgaattactattttcattaatagcatttaaccagccgggcaa SEQ ID NO：11。

其中，以含有cry3Bb基因的质粒为模板通过PCR扩增相应的基因片段作为探针序列，探针序列长度为553bp，序列为：

atggccaaccctaacaacaggtccgagcacgataccatcaaggtcacccctaactccgagctgcaaactaaccacaaccagtaccccctcgccgataacccgaacagcaccctggaagagctgaactacaaggagttcctcaggatgaccgaggattccagcactgaggtcctggacaactccaccgtcaaggatgccgtgggcaccggtatcagcgtcgtgggccagatcctcggcgtcgtgggtgtccctttcgccggcgcgctgacctccttctaccagtccttcctcaacactatctggcctagcgatgccgacccgtggaaggcgttcatggcccaggtcgaggtcctcatcgataagaagatcgaagagtacgccaagtccaaggcgctggccgagctgcaaggcctccagaacaacttcgaagattacgtcaacgccctcaactcctggaagaagacccctctgagcctccgctccaagcgctcccaggaccgcatccgcgagctgttcagccaggccgagtcccacttcaggaactccatgccga SEQ ID NO：12。

实施例4

质体转Bt-cry3Bb基因山新杨阳性苗的炼苗、移栽和表型分析：

把同质化抗性苗置于30mg/L壮观霉素的生根培养基中培养，把生根完好，生长健壮的同质化抗性苗的培养瓶逐步开盖，向全开盖的培养瓶中倒入适量蒸馏水，开盖3-4天炼苗，加入蒸馏水以使固体培养基变软容易清洗，然后清洗根上的培养基，再将根浸泡在蒸馏水中过夜，以使根系上的培养基彻底清除。培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度：30-40μE·m-²·s^-1，移栽入土培基质(土培基质配方为：蛭石:草炭土:珍珠岩＝5:3:2)中，置于培养箱中，每隔2-3天浇水1次，每隔1周浇1次1/8MS基本盐，光照条件为25℃16h光照/20℃8h黑暗，光照强度逐渐加强，从40μE·m^-2·s^-1左右升高到80μE·m^-2·s^-1左右，每隔3天升高10μE左右的强度，湿度从90％下降至65％逐渐下降，每隔3天左右下降5％的湿度，大约在培养箱培养至株高30厘米左右便可移栽到温室中用盆钵培养，培养条件：25℃16h光照/20℃8h黑暗，湿度50％左右。发现在温室中生长的质体转Bt-cry3Bb基因山新杨植株与野生型杨树植株在表型上没有明显差异，不影响植株正常生长。如图5所示。

实施例5

转Bt-cry3Bb基因山新杨抗虫性试验：

柳蓝叶甲测试饲养条件：12h光照：12h暗光周期下，保持温度为26℃和相对湿度为60％。所有的测试也是在此条件下进行。柳蓝叶甲生活史分为：卵、幼虫、蛹和成虫。卵期历期约3.3天，幼虫分为3期，1龄历期约2.1天，2龄历期约2.2天，3龄历期3.4天，蛹期约2.3天，成虫寿命较长，一般40-60天。在野外柳树上采集柳蓝叶甲幼虫和成虫，每个龄期随机选择90只幼虫，分别饲喂两个株系转基因杨树叶片或野生型杨树叶片(n＝30)，把野生型山新杨叶片和转Bt基因山新杨叶片盛放在无菌直径为90mm的培养皿中，用无菌水浸湿包裹叶柄，使叶片保湿，用毛笔分别轻轻移到野生型山新杨叶片和转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片上，每皿放置20-30只柳蓝叶甲幼虫和成虫，每个处理设3个重复，每隔24小时换一次叶片，每隔24小时左右，观察和记录幼虫和成虫的死亡情况。

从用山新杨野生型叶片和转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片对野外采集的柳蓝叶甲喂食试验中，从柳蓝叶甲死亡率的结果分析如下：柳蓝叶甲3龄幼虫在分别喂食野生型叶片12天后，存活率只要40％多一点，而喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片的，12天后全部死亡；柳蓝叶甲成虫在分别喂食野生型叶片6天后，存活率同样只要40％多一点，而喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片的，6天后全部死亡，见图6B,C。从用山新杨野生型叶片和转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片对人工饲养的柳蓝叶甲喂食试验中，从柳蓝叶甲死亡率的结果分析如下：柳蓝叶甲1龄幼虫在分别喂食野生型叶片1天后，全部存活，而喂食质体转Bt-cry3Bb基因山新杨叶片的，1天后全部死亡，见图6A。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种高抗柳蓝叶甲质体转Bt基因杨树新品种的获得方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Asn Pro Asn Asn Arg Ser Glu His Asp Thr Ile Lys Val Thr

1 5 1015

Pro Asn Ser Glu Leu Gln Thr Asn His Asn Gln Tyr Pro Leu Ala Asp

202530

Asn Pro Asn Ser Thr Leu Glu Glu Leu Asn Tyr Lys Glu Phe Leu Arg

354045

Met Thr Glu Asp Ser Ser Thr Glu Val Leu Asp Asn Ser Thr Val Lys

505560

Asp Ala Val Gly Thr Gly Ile Ser Val Val Gly Gln Ile Leu Gly Val

65707580

Val Gly Val Pro Phe Ala Gly Ala Leu Thr Ser Phe Tyr Gln Ser Phe

859095

Leu Asn Thr Ile Trp Pro Ser Asp Ala Asp Pro Trp Lys Ala Phe Met

100 105 110

Ala Gln Val Glu Val Leu Ile Asp Lys Lys Ile Glu Glu Tyr Ala Lys

115 120 125

Ser Lys Ala Leu Ala Glu Leu Gln Gly Leu Gln Asn Asn Phe Glu Asp

130 135 140

Tyr Val Asn Ala Leu Asn Ser Trp Lys Lys Thr Pro Leu Ser Leu Arg

145 150 155 160

Ser Lys Arg Ser Gln Asp Arg Ile Arg Glu Leu Phe Ser Gln Ala Glu

165 170 175

Ser His Phe Arg Asn Ser Met Pro Ser Phe Ala Val Ser Lys Phe Glu

180 185 190

Val Leu Phe Leu Pro Thr Tyr Ala Gln Ala Ala Asn Thr His Leu Leu

195 200 205

Leu Leu Lys Asp Ala Gln Val Phe Gly Glu Glu Trp Gly Tyr Ser Ser

210 215 220

Glu Asp Val Ala Glu Phe Tyr Arg Arg Gln Leu Lys Leu Thr Gln Gln

225 230 235 240

Tyr Thr Asp His Cys Val Asn Trp Tyr Asn Val Gly Leu Asn Gly Leu

245 250 255

Arg Gly Ser Thr Tyr Asp Ala Trp Val Lys Phe Asn Arg Phe Arg Arg

260 265 270

Glu Met Thr Leu Thr Val Leu Asp Leu Ile Val Leu Phe Pro Phe Tyr

275 280 285

Asp Ile Arg Leu Tyr Ser Lys Gly Val Lys Thr Glu Leu Thr Arg Asp

290 295 300

Ile Phe Thr Asp Pro Ile Phe Leu Leu Thr Thr Leu Gln Lys Tyr Gly

305 310 315 320

Pro Thr Phe Leu Ser Ile Glu Asn Ser Ile Arg Lys Pro His Leu Phe

325 330 335

Asp Tyr Leu Gln Gly Ile Glu Phe His Thr Arg Leu Gln Pro Gly Tyr

340 345 350

Phe Gly Lys Asp Ser Phe Asn Tyr Trp Ser Gly Asn Tyr Val Glu Thr

355 360 365

Arg Pro Ser Ile Gly Ser Ser Lys Thr Ile Thr Ser Pro Phe Tyr Gly

370 375 380

Asp Lys Ser Thr Glu Pro Val Gln Lys Leu Ser Phe Asp Gly Gln Lys

385 390 395 400

Val Tyr Arg Thr Ile Ala Asn Thr Asp Val Ala Ala Trp Pro Asn Gly

405 410 415

Lys Val Tyr Leu Gly Val Thr Lys Val Asp Phe Ser Gln Tyr Asp Asp

420 425 430

Gln Lys Asn Glu Thr Ser Thr Gln Thr Tyr Asp Ser Lys Arg Asn Asn

435 440 445

Gly His Val Ser Ala Gln Asp Ser Ile Asp Gln Leu Pro Pro Glu Thr

450 455 460

Thr Asp Glu Pro Leu Glu Lys Ala Tyr Ser His Gln Leu Asn Tyr Ala

465 470 475 480

Glu Cys Phe Leu Met Gln Asp Arg Arg Gly Thr Ile Pro Phe Phe Thr

485 490 495

Trp Thr His Arg Ser Val Asp Phe Phe Asn Thr Ile Asp Ala Glu Lys

500 505 510

Ile Thr Gln Leu Pro Val Val Lys Ala Tyr Ala Leu Ser Ser Gly Ala

515 520 525

Ser Ile Ile Glu Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Asn Leu Leu Phe Leu

530 535 540

Lys Glu Ser Ser Asn Ser Ile Ala Lys Phe Lys Val Thr Leu Asn Ser

545 550 555 560

Ala Ala Leu Leu Gln Arg Tyr Arg Val Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Thr

565 570 575

Thr Asn Leu Arg Leu Phe Val Gln Asn Ser Asn Asn Asp Phe Leu Val

580 585 590

Ile Tyr Ile Asn Lys Thr Met Asn Lys Asp Asp Asp Leu Thr Tyr Gln

595 600 605

Thr Phe Asp Leu Ala Thr Thr Asn Ser Asn Met Gly Phe Ser Gly Asp

610 615 620

Lys Asn Glu Leu Ile Ile Gly Ala Glu Ser Phe Val Ser Asn Glu Lys

625 630 635 640

Ile Tyr Ile Asp Lys Ile Glu Phe Ile Pro Val Gln Leu

645 650

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gcggccgctc agagctggac agggatgaac tc 32

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggccaa ccctaacaac aggtc 25

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggtatatct ccttcttaaa gttaaactgc agtatttg 38

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggtacttgt gatatttcgg cttg 24

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttagccaaag gtgtacgttc atgag 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ttgcccggct ggttaaatgc 20

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggccaacc ctaacaacag gtc 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcggcatgga gttcctgaag tg 22

<210> 10

<211> 1962

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atggccaacc ctaacaacag gtccgagcac gataccatca aggtcacccc taactccgag 60

ctgcaaacta accacaacca gtaccccctc gccgataacc cgaacagcac cctggaagag 120

ctgaactaca aggagttcct caggatgacc gaggattcca gcactgaggt cctggacaac 180

tccaccgtca aggatgccgt gggcaccggt atcagcgtcg tgggccagat cctcggcgtc 240

gtgggtgtcc ctttcgccgg cgcgctgacc tccttctacc agtccttcct caacactatc 300

tggcctagcg atgccgaccc gtggaaggcg ttcatggccc aggtcgaggt cctcatcgat 360

aagaagatcg aagagtacgc caagtccaag gcgctggccg agctgcaagg cctccagaac 420

aacttcgaag attacgtcaa cgccctcaac tcctggaaga agacccctct gagcctccgc 480

tccaagcgct cccaggaccg catccgcgag ctgttcagcc aggccgagtc ccacttcagg 540

aactccatgc cgagcttcgc ggtctccaag ttcgaagtcc tcttcctgcc gacctacgcc 600

caggccgcga acacccacct cctgctcctg aaggatgccc aggtcttcgg cgaggaatgg 660

ggctactcca gcgaggacgt cgcggagttc tacaggcgcc agctcaagct cacccagcag 720

tacaccgacc actgcgtcaa ctggtacaac gtgggtctga acggcctccg cggctccact 780

tacgatgcct gggtcaagtt caacaggttc cgccgcgaga tgaccctcac cgtcctggat 840

ctcatcgtgc tcttcccgtt ctacgacatc aggctgtact ccaagggcgt caagactgag 900

ctgacccgcg atattttcac cgaccctatc ttcctcctca ctaccctgca aaagtacggc 960

ccgaccttcc tctccatcga gaacagcatc cgcaagcctc acctgttcga ttacctccag 1020

ggtatcgagt tccacactcg cctccagccg ggctacttcg gtaaggattc cttcaactac 1080

tggtccggca actacgtcga gaccaggcct agcatcggct cctccaagac catcactagc 1140

ccgttctacg gtgataagtc caccgagccc gtccagaagc tctccttcga tggccagaag 1200

gtctacagga ccatcgccaa cactgacgtg gcggcctggc ctaacggcaa ggtctacctc 1260

ggtgtcacca aggtggactt ctcccagtac gatgaccaga agaacgagac cagcactcag 1320

acctacgatt ccaagcgcaa caacggccac gtctccgccc aggacagcat cgaccagctc 1380

ccgcctgaga ccactgacga accgctggag aaggcctact cccaccagct caactacgcg 1440

gagtgcttcc tcatgcagga tcgccgcggc accatcccgt tcttcacctg gactcaccgc 1500

tccgtggact tcttcaacac catcgatgcc gagaagatca cccagctccc tgtcgtgaag 1560

gcctacgcgc tgtccagcgg cgcctccatc atcgagggtc ctggcttcac cggcggtaac 1620

ctcctcttcc tgaaggagtc cagcaactcc atcgccaagt tcaaggtcac cctcaactcc 1680

gctgccctgc tccagcgcta ccgcgtccgc atccgctacg ccagcaccac taacctcagg 1740

ctgttcgtcc agaactccaa caacgatttc ctcgtgatct acatcaacaa gaccatgaac 1800

aaggacgacg acctcaccta ccagactttc gatctggcca ccaccaactc caacatgggc 1860

ttcagcggtg acaagaacga gctgatcatc ggcgccgaat ccttcgtcag caacgagaag 1920

atttacatcg ataagatcga gttcatccct gtccagctct ga 1962

<210> 11

<211> 587

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ttagccaaag gtgtacgttc atgagcccat gctaaagttt caatcaattc ctgccaatat 60

ccgcgccagg aaattaagaa cataaatcca gtagcccaaa caagatgtcc aaataagaac 120

atccatgccc agaccgataa actattcatc ccaaaggggt tatacccatt gataagttgt 180

gaagagttta accataaata atctcttaac catcccatca aataagtaga agattcatta 240

aactgtgaaa cgttaccctg ccataatgtt atgtgcttcc aatgccaata aaaagtaacc 300

catccaatgg tatttaacat ccagaaaacc gccaaataaa atgcgtccca agccgaaata 360

tcacaagtac cgcctcgtcc cggaccatcg caaggaaaac tataaccaaa atccttttta 420

tctggcatta acttagaacc acgcgcatct aaagcacctt ttactaagat caatgtagtt 480

gtatgtaaac ctagagcaat agcatgatga accaagaagt ctccaggccc tattgttaag 540

aataatgaat tactattttc attaatagca tttaaccagc cgggcaa 587

<210> 12

<211> 553

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atggccaacc ctaacaacag gtccgagcac gataccatca aggtcacccc taactccgag 60

ctgcaaacta accacaacca gtaccccctc gccgataacc cgaacagcac cctggaagag 120

ctgaactaca aggagttcct caggatgacc gaggattcca gcactgaggt cctggacaac 180

tccaccgtca aggatgccgt gggcaccggt atcagcgtcg tgggccagat cctcggcgtc 240

gtgggtgtcc ctttcgccgg cgcgctgacc tccttctacc agtccttcct caacactatc 300

tggcctagcg atgccgaccc gtggaaggcg ttcatggccc aggtcgaggt cctcatcgat 360

aagaagatcg aagagtacgc caagtccaag gcgctggccg agctgcaagg cctccagaac 420

aacttcgaag attacgtcaa cgccctcaac tcctggaaga agacccctct gagcctccgc 480

tccaagcgct cccaggaccg catccgcgag ctgttcagcc aggccgagtc ccacttcagg 540

aactccatgc cga 553