一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用

摘要

本发明公开了一种人脑胶质瘤细胞系，所述人脑胶质瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.16693，保藏日期为：2018年11月07日。本发明的人脑胶质瘤细胞系可稳定多次传代，具有成瘤性，可以制备出肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。而且，本发明利用胶质瘤干细胞分化为胶质瘤细胞，首先可以减少杂细胞的数量，胶质瘤干细胞分化为胶质瘤细胞后，生长速度快，增殖能力强，保留了脑胶质瘤病理组织的特征。

说明书

技术领域

本发明属于医学领域，具体涉及一种人脑胶质瘤细胞系及其建立方法和应用。

背景技术

脑胶质瘤是中枢神经常见的肿瘤，发病率约为3-5/10万人。组织学分四级：I级、II级呈低恶性度，具有良性生物学特性；III级和IV级为高级别胶质瘤，特别是胶质母细胞瘤，其中位生存期仅为12-18个月，间变胶质瘤(WHO III级)的中位生存期为2-5年，低级别胶质瘤(WHO I、II级)的中位生存期也仅为4-10年。

虽然目前神经外科手术技巧在不断进步，手术仪器越来越先进，结合放、化疗也取得了新的进展，另外还有一些新的治疗方法，如免疫治疗、以EGFR、IGFR、PDGFR等为靶点的靶向治疗和抗血管生成的治疗方法，这些方法通常根据患者的实际情况进行联合应用。但胶质瘤的5年生存率并没有得到明显提高，其主要原因是脑胶质瘤的高复发性和异质性以及脑胶质瘤患者在化疗过程中出现耐药现象，这严重的影响了脑胶质瘤的治疗效果。因此，临床上不仅需要新型的治疗方法，同时也需要开发有效的治疗药物。

然而，目前在全世界范围，用于药物开发和基础研究的脑胶质瘤细胞系屈指可数，如LN-229、U-87MG、U-118MG和U-138MG等细胞系均来源于白种人，具有亚洲人种遗传背景的脑胶质瘤细胞系更是凤毛麟角，同临床上数量众多的脑胶质瘤患者相比，脑胶质瘤细胞系稀少的问题严重地制约了临床前研究。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种人脑胶质瘤细胞系。

本发明的目的之二在于提供一种上述人脑胶质瘤细胞系的子代细胞系。

本发明的目的之三在于提供一种基于上述人脑胶质瘤细胞系的遗传改造细胞系。

本发明的目的之四在于提供上述人脑胶质瘤细胞系的建立方法。

本发明的目的之五在于提供上述子代细胞系的获取方法。

本发明的目的之六在于提供一种肿瘤动物模型。

本发明的目的之七在于提供上述人脑胶质瘤细胞系、上述子代细胞系、上述肿瘤动物模型、上述建立方法和获取方法的用途。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种人脑胶质瘤细胞系，所述人脑胶质瘤细胞系在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.16693，保藏日期为：2018年11月07日。

一种子代细胞系，所述子代细胞系是由上述人脑胶质瘤细胞系传代得到的。

一种遗传改造的细胞系，所述遗传改造的细胞系是由上述人脑胶质瘤细胞系或上述子代细胞系经遗传改造得到的具有致瘤性的细胞系。

一种上述人脑胶质瘤细胞系的建立方法，依次包括如下步骤：

(a)获取临床人脑胶质瘤组织；

(b)利用所述临床人脑胶质瘤组织构建人源性肿瘤组织异种移植模型动物；

(c)对来源于所述人源性肿瘤组织异种移植模型动物的肿瘤组织进行原代培养；

(d)对所述原代培养的肿瘤细胞进行传代培养，获得所述人脑胶质瘤细胞系。

在上述建立方法中，作为一种优选实施方式，所述人源性肿瘤组织异种移植模型动物的构建过程中使用的动物为哺乳动物；更优选地，所述哺乳动物为裸小鼠。

在上述建立方法中，作为一种优选实施方式，所述原代培养采用的培养基为：含有人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、B27营养因子和青链霉素的Neurobasal培养液，其中，人表皮生长因子的含量为20ng/ml，人成纤维细胞生长因子的含量为20ng/ml，B27营养因子的含量为2vol％(体积百分比)，青链霉素的含量为1vol％(体积百分比)。

在上述建立方法中，作为一种优选实施方式，所述传代培养包括：胶质瘤干细胞(即原代培养得到的细胞)传代培养和干细胞分化的胶质瘤细胞的传代培养。优选地，所述胶质瘤干细胞传代培养采用的培养基为：含有人表皮生长因子、人成纤维细胞生长因子、B27营养因子和青链霉素的Neurobasal培养液，其中，人表皮生长因子的含量为20ng/ml，人成纤维细胞生长因子的含量为20ng/ml，B27营养因子的含量为2vol％，青链霉素的含量为1vol％；所述干细胞分化的胶质瘤细胞的传代培养采用的培养基为：含有胎牛血清和青链霉素的DMEM培养液，其中，在所述DMEM培养液中，所述胎牛血清的体积百分含量为10％，青链霉素的体积百分含量为1％。

在上述建立方法中，作为一种优选实施方式，步骤(c)中，来源于所述人源性肿瘤组织异种移植模型动物的肿瘤组织是将临床人脑胶质瘤组织在哺乳动物体内经多次移植培养后得到的；更优选地，来源于所述人源性肿瘤组织异种移植模型动物的肿瘤组织是将临床人脑胶质瘤组织在哺乳动物体内经2-3次移植培养后得到的。

一种上述子代细胞系的获取方法，采用含有胎牛血清和青链霉素的DMEM培养液对上述人脑胶质瘤细胞系继续进行传代培养，从而获得所述子代细胞系，其中，在所述DMEM培养液中，所述胎牛血清的体积百分含量为10％，青链霉素的体积百分含量为1％。

一种肿瘤动物模型，所述肿瘤动物模型是通过将上述人脑胶质瘤细胞系、上述子代细胞系或上述遗传改造的细胞系接种到哺乳动物体内形成的，优选，所述动物为小鼠。

上述人脑胶质瘤细胞系、上述子代细胞系、上述遗传改造的细胞系、上述肿瘤动物模型、上述人脑胶质瘤细胞系的建立方法、或者上述子代细胞系的获取方法在开发抑制人脑胶质瘤药物方面的用途、在制备人脑胶质瘤诊断试剂方面的用途、或者在用于人脑胶质瘤体外研究方面的用途。

本发明的人脑胶质瘤细胞系，命名为BT-127，属于人胶质母细胞瘤，于2018年11月07日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.16693。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的人脑胶质瘤细胞系可稳定多次传代，具有成瘤性，可以制备出肿瘤动物模型，其可用于人脑胶质瘤诊断试剂的研发、人脑胶质瘤药物的筛选、以及人脑胶质瘤的体外研究。另外，本发明的人脑胶质瘤细胞系的建立方法简单易操作，由于组织标本珍贵又少，用PDX模型既可以留存组织标本，又可以对肿瘤细胞进行体内筛选，增殖活跃的一部分肿瘤细胞更易生长，原代培养更易成功，肿瘤细胞建系更易成功。而传统的直接采用人脑胶质瘤组织进行原代培养的方式难度大、细胞不易存活。而且，本发明利用胶质瘤干细胞分化为胶质瘤细胞，首先可以减少杂细胞的数量，胶质瘤干细胞分化为胶质瘤细胞后，生长速度快，增殖能力强，保留了脑胶质瘤病理组织的特征。

附图说明

图1为BT-127细胞的形态显微照片；其中，图1-A为BT-127细胞G1代培养的照片(100×)；图1-B为细胞密度较大时BT-127细胞G1代培养的照片(100×)；图1-C为BT-127细胞G20代培养的照片；图1-D为BT-127细胞G50代培养的照片。

图2为BT-127细胞的染色体分型显微照片；其中，(a)为显微镜下拍摄照片；(b)为重新排列后的照片。

图3为患者脑胶质瘤组织与裸鼠移植瘤组织在病理形态照片，其中，(a)为患者脑胶质瘤组织；(b)为F3代移植瘤组织。

图4为患者脑胶质瘤组织与裸鼠移植瘤组织免疫组化染色结果照片；其中，(a-1)为患者脑胶质瘤组织的细胞增殖标记物Ki67；(a-2)为F3代移植瘤组织的细胞增殖标记物Ki67；(b-1)为患者脑胶质瘤组织的神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白GFAP；(b-2)为F3代移植瘤组织神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白GFAP；(c-1)为患者脑胶质瘤组织的神经特异性蛋白S100；(c-2)为F3代移植瘤组织的神经特异性蛋白S100。

图5为BT-127细胞的GFAP免疫荧光染色结果展示照片，其中，(a)为细胞内GFAP染色；(b)为细胞核染色；(c)为GFAP和细胞核染色叠加图片。

图6为肿瘤倍增时间对照曲线图。

图7为细胞成瘤照片。

图8为溶瘤病毒杀伤BT-127肿瘤细胞照片。

图9为溶瘤病毒杀伤F3移植瘤组织中肿瘤细胞的结果图，其中A为肿瘤体积随时间的变化曲线图，B为注射溶瘤病毒后不同时间点小鼠中肿瘤大小的照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。

本发明所作研究经首都医科大学附属北京天坛医院医学伦理委员会批准。

本实施例可以采用F1代的移植瘤组织进行原代培养和传代培养，也可以采用F2代或F3代的移植瘤组织进行原代培养和传代培养，对来源于PDX模型动物的肿瘤组织可以采用本领域常规的原代培养方法和传代培养方法进行细胞系的建立，但优选采用以下实施例一中记载的方法。

本发明通过建立脑胶质瘤PDX模型支持原代肿瘤组织生长，HE染色和免疫组织化学染色证实了F3代移植瘤组织保留了原脑胶质瘤组织的组织学亚型及表型特点；本发明优选取F3代增殖活跃的移植瘤组织块进行原代培养，采用Neurobasal培养液纯化培养原代细胞，然后使用含有胎牛血清的DMEM培养液培养，获得能在体外长期生长和稳定传代的BT-127细胞。

对BT-127细胞进行相关的生物学、遗传学和组织来源鉴定，直至第G50代都具有相同的稳定的性状。经实验观察与验证，体外生长的BT-127主体呈梭型，存在不规则分支或分叉，细胞密度较大时接触生长抑制不明显，呈交叉堆积生长状态，经过50次传代后，细胞的形态仍保持不变。遗传学研究证实该细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。该细胞能在裸鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

本细胞系的建立有以下特点，病理组织取自复发胶质瘤患者的病理组织，首先利用该病理组织建立了PDX模型，并且能稳定传代。取稳定传代的病理组织培养胶质瘤干细胞，传3代后，将干细胞分化为胶质瘤细胞，该胶质瘤细胞能稳定传代50次以上。

具体操作与结果参见下文。

实施例一人脑胶质瘤细胞系BT-127的构建方法

1、病人组织样本处理

1.1患者情况概述：

该患者，男，37岁，诊断为胶质母细胞瘤，在本次脑胶质瘤组织切除手术之前经历过2次胶质瘤手术，而此次复发的脑胶质瘤除了颅内原发灶还发生了头皮下转移，可见此例脑胶质瘤的侵袭性非常强，对于脑胶质瘤转移到颅外的案例很少，因此将转移到颅外的病理组织培养成PDX模型，进而培养成胶质瘤细胞系的数量更不多，因此本发明的人脑胶质瘤细胞系对于研究胶质瘤的侵袭和转移以及药物试验等都有重要的意义。

另外，此患者在该次脑胶质瘤组织切除手术前进行了放化疗，因此本发明的人脑胶质瘤细胞系极有可能对放化疗耐受，由此建立的PDX模型可能具有抵抗放化疗的能力，因此该细胞系对于研究溶瘤病毒对胶质瘤的治疗作用具有重要的意义。

1.2组织样本处理

将上述患者手术获得的新鲜脑胶质瘤切除标本(男，37岁，胶质母细胞瘤)立即置于预冷的DMEM/F12培养基(含1vol％的青链霉素，本发明的青链霉素购自购自Gibco，货号15140122，其中每毫升包含10000单位青霉素(碱)和10000μg链霉素(碱)，利用0.85wt％盐液形式的青霉素G(钠盐)和硫酸链霉素)中短暂存放，以保证样本在到达实验室前的活性，注意组织采集和运送过程中保持无菌。

在无菌超净工作台中取出样本，放置于10cm无菌培养皿中，加入5ml预冷的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次，尽可能的洗去血液及杂质，然后用消毒好的眼科镊去除可辨认的坏死部位及血管后，将胶质瘤组织移入新的10cm无菌培养皿中剪成2x2x3mm的组织块，加入5ml预冷的PBS缓冲液(pH＝7.4)放置冰上待用。本过程无菌操作，在30分钟以内完成。

2、PDX(人源性肿瘤组织异种移植)模型动物的构建

选取6-8周龄雄性BALB/c-nu裸鼠，在常规消毒、麻醉条件下，切开裸鼠右侧前肢腋窝皮肤约0.5cm长，将肿瘤组织块接种至皮下，缝合切口。

待肿瘤生长到直径约1cm，常规处死小鼠，在无菌条件下切除肿瘤，获得的移植瘤组织命名为F1代，将一部分F1代移植瘤组织放在STEM-CELL Banker冻存液中置于-80度冰箱冻存，3日后移至液氮罐内保存。

剩余F1代移植瘤组织继续以上述方法在裸鼠皮下传代，获得的移植瘤组织命名为F2代，以后每传一代均取一部分移植瘤组织按上述方法转移到液氮内保存。

重复前述步骤得到F3代。

3、原代培养

在无菌超净台中，取F3代新鲜的肿瘤组织(大小为4mm x 4mm x 4mm)放置于10cm无菌培养皿中，加入5ml 4℃预冷的PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗3次，尽可能清洗掉组织块上的血液和杂质。然后用消毒好的眼科镊去除可辨认的坏死部位及血管后，将肿瘤组织移入新的10cm无菌培养皿中剪成<1mm³的小块。用滴管将剪碎的组织块吸入至15ml离心管中并加入10ml>2条件下培养3天。

4、传代培养

原代培养3天后，可以观察到形成的神经球(即胶质瘤干细胞)悬浮于培养液中，收集培养液，300g离心3分钟去上清，再加入10ml新鲜Neurobasal培养液(含20ng/ml人表皮生长因子、20ng/ml人成纤维细胞生长因子、2vol％B27营养因子(购自Gibco)、1vol％的青链霉素)将神经球重悬于新的Nerobasal培养液中于10cm无菌培养皿中继续培养，直到神经球直径大于3.0mm时，用移液枪挑取神经球置于15ml离心管中，加入3ml PBS缓冲液(pH＝7.4)缓慢冲洗神经球，300g离心3分钟弃上清，细胞沉淀使用1ml1×Accutase(Gibco，货号A1110501)重悬消化约10分钟，待细胞分散后300g离心3分钟；然后将收集的细胞重悬于10ml Neurobasal培养液(同原代培养中使用的相应培养液)中，于新的10cm无菌培养皿中继续培养，神经球直径大于3.0mm时，传代。

细胞按上述传代方法继续培养三代，然后将Neurobasal培养液更换为DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)进行培养，细胞将由悬浮生长转变成贴壁生长，并将初次贴壁生长的细胞命名为BT-127胶质瘤细胞，细胞代数记为G1代。G1代细胞生长至80％-90％汇合度时继续进行传代培养，培养方法如下：

倒出培养瓶中陈旧培养液，加入2ml PBS缓冲液(pH＝7.4)缓慢摇晃冲洗细胞，并弃去冲洗液。向培养瓶中加入约1ml 0.05％胰蛋白酶溶液室温消化1分钟左右，镜下可见贴壁细胞呈现小圆形而悬浮游动，向培养瓶中加入2ml DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)终止消化，滴管反复吹打，动作注意轻柔，最大程度使胶质瘤细胞分散为单个细胞，然后移入15ml无菌离心管，800转/min离心3分钟后去除上清液。向离心管内加入6ml新的DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)，滴管反复吹吸分散细胞，注意动作轻柔，将该6ml细胞混合液均分入3个培养瓶中，再在3个培养瓶中各加入3ml新的DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)，每个培养瓶中的培养液总体积为5ml，并将步骤培养后的得到的传代细胞记为G2代，当G2代细胞生长至80％-90％汇合度时继续按上述传代培养方法进行传代，BT-127胶质瘤细胞生长良好，形态较为均一，可传代至50代以上。

实施例二BT-127细胞的形态学观察

将培养BT-127细胞的培养瓶置于倒置显微镜下，在明视野下进行观察，图1为BT-127细胞G1代培养的照片，结果可见BT-127细胞主体呈梭型，存在不规则分支或分叉(图1-A，100×)；细胞密度较大时接触生长抑制不明显，呈交叉堆积生长状态，且由聚集处向外辐射生长(图1-B，100×)。

图1-C为BT-127细胞G20代培养的照片。图1-D为BT-127细胞G50代培养的照片。由图1的A-D四幅图比较可知，经过50次传代后，细胞的形态仍保持不变，这说明本发明所制备的BT-127细胞能够稳定地传代，有助于长期深入研究该细胞系的生理病理特征、遗传特征，有助于将其作为药物测试等平台细胞系或诱导肿瘤动物模型的细胞系。

实施例三BT-127细胞的染色体核型分析

取对数期生长的BT-127细胞，加入秋水仙素，使其终浓度为0.2μg/ml，于37℃温箱中继续培养4小时。采集分裂中期的细胞，用固定液(甲醇：冰乙酸＝3：1(V/V)，现用现配)进行固定约1小时，然后将细胞悬液滴于预冷的载物片上，用Giemas染色液染色，于显微镜下计数染色体数。结果见图2，BT-127细胞连续传代后，染色体仍保持人源性肿瘤细胞染色体的特征，染色体众数(M)集中在45～55之间，占70％，可见该BT-127细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变严重，符合恶性肿瘤的遗传学特征。

实施例四BT-127细胞短片段重复序列(STR)分析

短串联重复序列(short tandem repeat，STR)又称为微卫星DNA，是指染色体上，由数个碱基对作为核心单位(2～6个碱基对)，串联重复形成的一类DNA序列(重复次数为10～60多次，基因片段在400碱基对以下)；每个核心单位重复的次数会出现个体差异，从而形成片段长度不同的等位基因。因此，一组STR序列的重复次数在不同个体中几乎是唯一的，是个体的基因身份特征，也是细胞生物学对细胞身份和来源进行鉴定的主要方法。

取新鲜培养的BT-127细胞用Microread Genomic DNA Kit提取DNA，采用Microreader^TM21ID>

表1 STR情况汇总表

实施例五组织来源鉴定

取F3代移植瘤组织和原脑胶质瘤组织分别进行固定后石蜡包埋，制备切片并进行HE染色和免疫组织化学染色。HE染色结果显示，F3代移植瘤组织和原脑胶质瘤组织在组织形态和组织结构上呈现高度的一致性，参见图3，移植瘤组织保留了原脑胶质瘤组织的组织学亚型；免疫组化染色结果显示，参见图4，细胞增殖标记物Ki67、神经特异性蛋白S100和神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白(GFAP)在F3代移植瘤组织和原脑胶质瘤组织中的表达无统计学差异，证实了裸鼠移植瘤组织保留了原脑胶质瘤组织的表型特点。

进一步将G42代BT-127细胞接种在盖玻片上培养，待细胞伸展后，用4％甲醛固定，进行免疫荧光染色。参见图5，结果显示神经胶质细胞标志物神经胶质酸性蛋白(GFAP)呈较强阳性表达，结合病理诊断，该细胞为脑胶质瘤细胞。

由上述结果可知，本发明的BT-127细胞能够表达胶质瘤细胞的典型标记物，进而判断该细胞系具有典型的肿瘤特征。

实施例六细胞增殖和倍增时间

取新鲜培养的BT-127细胞铺于96孔板内，细胞计数后，每孔的细胞量为3000个，每孔加入100μl DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)，对照孔加入100μlPBS缓冲液(pH＝7.4)，各铺7个96孔板，分别于第24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、144小时、168小时后取出对应96孔板，吸尽孔中的培养基后，每孔加入100μl新鲜的DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)与10μl CCK8的混合溶液(Dojindo，货号CK04)37℃恒温箱内避光孵育1小时。酶标仪测定在450nm处的吸光度值，作图并使用公式“倍增时间＝log2/斜率”计算倍增时间。细胞动力学研究结果显示，BT-127细胞的群体倍增时间约为40小时(参见图6)，表明BT-127细胞活力很好，能作为细胞模型应用于胶质瘤相关研究。

实施例七异种移植试验

取新鲜培养的BT-127细胞，皮下接种BALB/C免疫缺陷小鼠(北京维通利华，雄性，鼠龄6周)，每只动物接种0.2ml，含5×10⁶个细胞，每天观察和测量动物体重和肿瘤大小。接种约5天后，肿瘤开始形成并生长，成瘤率近100％。结果如图7所示，可见该BT-127细胞能在免疫缺陷小鼠体内形成肿瘤，具有致瘤性。

由此可知，可以通过接种BT-127细胞能够在小鼠体内形成肿瘤，从而形成肿瘤动物模型。

实施例八体外药敏试验

体外测定脑胶质瘤临床常用治疗药物：替莫唑胺和洛莫司汀，对BT-127细胞和脑胶质瘤细胞系LN-229(来源ATCC，CRL-2611)细胞的抗增殖作用。收集对数生长期G46代BT-127细胞和脑胶质瘤细胞系LN-229细胞，调整细胞悬液浓度，在96孔板中接种细胞悬液(100μl/孔)，每孔10000个细胞，置于37℃、5％CO₂培养箱中预培养24小时后，分别加入替莫唑胺和洛莫司汀以及空白对照，药物终浓度为3μM，继续置于37℃、5％CO₂培养箱中培养。药物作用24小时后，用CCK8试剂检测细胞活力。具体步骤如下：吸尽孔板中细胞培养液，再向每孔中加入100微升DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)和10微升CCK8溶液，将孔板再次放入培养箱内孵育1小时，利用酶标仪测定450nm处的吸光度，结果如表2所示，我们发现各治疗药物对BT-127细胞的生长抑制作用比对LN-229细胞的作用弱，说明BT-127细胞较LN-229细胞更为耐药，能够作为筛选新型抗肿瘤药物的细胞模型。

表2

实施例九新型溶瘤病毒杀伤细胞的疗效评价

溶瘤病毒是指将天然的或经过基因重组的病毒选择性地感染癌细胞，通过病毒自身的功能杀死并裂解癌细胞，同时它还能激发免疫反应，吸引更多免疫细胞来继续杀死残余癌细胞。新型溶瘤病毒是基于单纯疱疹病毒进行基因改造制成的溶瘤病毒，并携带了绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因，该新型溶瘤病毒的构建是按照申请号2004100064921，授权公告号CN1283803C的专利申请中记载的方法将野生型HSV-1病毒(其基因序列的GenBank号：NC_001806)的ICP34.5基因和ICP47基因敲除，并在HSV-1病毒的敲除ICP34.5基因的位置插入由MMLV启动子引导的编码绿色荧光蛋白的基因。

将胶质瘤细胞U87MG(来源ATCC，HTB-14)、U251MG(来源ATCC)、BT-127细胞的G1和BT-127的G50代细胞分别铺板于96孔板内，每孔加入5000个细胞和100μl DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)放入37℃温箱5％CO₂条件下培养。24小时后可认为接种细胞生长至10⁴个每孔，将溶瘤病毒按MOI(即感染复数，指感染时病毒与细胞数量的比值)为10⁰、10^-1、10^-2、10^-3和10^-4五个滴度加入相应的孔板中，对照组加入相同体积的DMEM培养液(含10vol％胎牛血清、1vol％的青链霉素)，然后将96孔板放入37℃细胞培养箱内孵育48小时，荧光显微镜下观察并拍照。荧光显微镜下可见新型溶瘤病毒对BT-127细胞具有杀伤作用，且病毒滴度越高杀伤效果越明显，如图8所示，随着MOI值增加，新型溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制增多(EGFP表达增多)，当MOI值达到10⁰时，部分肿瘤细胞已经死亡，镜下可见EGFP表达下降。

实施例十新型溶瘤病毒对移植瘤模型的作用

取F3代移植瘤组织按上述PDX模型构建中方法接种于裸鼠(选取6-8周龄雄性BALB/c-nu裸鼠)皮下生长，将裸鼠分为对照组和实验组，待裸鼠皮下移植瘤组织块直径接近0.6cm时，将实施例九中的新型溶瘤病毒注射到移植瘤组织中，观察新型溶瘤病毒对移植瘤的作用。对照组的瘤组织注射等量的生理盐水，实验组注射浓度为3.75×10⁸pfu/ml的新型溶瘤病毒。每2日观察裸鼠皮下移植瘤的变化，如有无出血坏死等情况，并分别量取对照组和实验组移植瘤的长和宽，做好记录。

参见图9A，2周后可见实验组移植瘤明显缩小，而对照组移植瘤仍有继续生长的趋势，注射病毒14天后，将裸鼠处死，取瘤组织，参见图9B溶瘤病毒处理后明显抑制了胶质瘤的生长。

由技术常识可知，本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。