Identification et caractérisation du gène p49 du granulovirus de Choristoneura fumiferana (ChfuGV) : expression de la protéine P49 recombinante dans un système procaryote et eucaryote et production d'anticorps anti-P49

摘要

L'infection associée au granulovirus de Choristoneura fumiferana (ChfuGV) fait intervenir plusieurs protéines virales dont la majorité ne sont pas encore identifiées. Parmi ces protéines, la P49 retrouvée chez certains baculovirus joue un rôle majeur lors de la pathogenèse virale. Cette protéine inhibe le processus apoptotique induit par les cellules hôtes, comme système de défense, lors de l'infection virale. Ce projet de recherche rapporte, pour la première fois, la présence et la caractérisation du gène codant pour la protéine P49 chez le ChfuGV.udududLe gène p49 a été localisé sur le brin anti-sens du génome de ChfuGV, entre les positions 8 632 pb et 9 999 pb, et immédiatement en aval du gène viral codant pour la protéine structurale ODVe-18. Ce gène code pour une protéine de 455 acides aminés, ayant une masse moléculaire de 53 k.Da. Les analyses des séquences nucléotidiques et en acides aminés ont permis de confirmer l'identité du gène p49 au sein des granulovirus étudiés. La séquence de la protéine P49 de ChfuGV partage une homologie de 40-55% avec celle des autres GV. Toutefois, les faibles homologies obtenues avec les baculovirus de t}ipe nucléopolyédrovirus (NPV) ont suggéré une divergence évolutive entre les GV et les NPV au niveau de la protéine P49.udududDans le but d'une caractérisation immunobiologique, la protéine recombinante P49 a été produite dans les bactéries E. coli MIS [pREP4] en utilisant le système d'expression procaryote pQE32. La purification de la protéine recombinante P49 a été effectuée en conditions dénaturantes par chromatographie d'affinité sur colonne de nickel (Ni-NTA}. Le rendement obtenu de la purification correspond à environ 5.5 mg/litre de culture. L'utilisation de la protéine recombinante P49 lors de l'immunisation classique des souris Balb/c a permis la production d'anticorps polyclonaux anti-P49 spécifiques. Les analyses par ELISA ont démontré que l'induction des réponses en anticorps anti-P49 par immunisation classique est efficace, avec des titres importants à partir du 41ème jour post-immunisation.udududAu cours du projet, il a été également question d'explorer l'efficacité de l'immunisation génétique (ADN nu) dans la production des anticorps anti-P49, comparativement à l'immunisation classique. L'immunisation génétique des souris Balb/c, en utilisant le système d'expression eucaryote pcDNA3 exprimant la protéine P49 (pcDNA3/p49), a permis la production d'anticorps anti-P49 très spécifiques. Les titres des anticorps générés sont d'environud103 et ont été atteints au bout du 81ème jour post-immunisation. Cette réponse en anticorps anti­-P49 s'est ainsi avérée plus faible et plus tardive que celle générée par l'immunisation classique. Toutefois, les titres des anticorps anti-P49 produits par immunisation génétique ne tiennent compte d'aucune protéine contaminante d'origine bactérienne. En effet, contrairement aux anticorps générés par immunisation classique, les anticorps anti-P49 produits par immunisation génétique résultent strictement de l'immunogénicité de la protéine P49. En plus de cette spécificité des anticorps, l'immunisation génétique s'est avérée une méthode moins coûteuse, plus rapide et largement moins laborieuse que 1'immunisation classique. De ce fait, l'immunisation génétique a été considérée comme étant une approche plus fiable pour la production des anticorps anti-P49.udududLes expériences d'immunisation génétique ont permis également de confirmer le potentiel immuno-adjuvant du plasmide codant pour l'IL-2. En effet, cette étude a démontré que la réponse humorale peut être améliorée par la co-injection du vecteur exprimant cette cytokine (pcDNA3/IL-2) en présence du vecteur codant pour la P49. L'IL-2 a ainsi permis d'activer l'induction de la réponse humorale et d'augmenter de plus de 10 fois les titres des anticorps anti­ P49, par rapport à l'immunisation en l'absence de cette cytokine.