Oxidation von atmosphärischem Methan in Böden: Ein neuer quantitativer Ansatz zur Erfassung der Struktur und Aktivität methanotropher Gilden

摘要

Atmosphärisches Methan ist nach Kohlendioxid das zweit wichtigste Treibhausgas. Aufgrund anthropogener Eingriffe steigt die Methankonzentration derzeit jährlich um 1 %. Wichtigste Quelle ist die Emission von Methan aus Feuchtgebieten (z.B. Mooren und gefluteten Reisfeldern). Neben dem Abbau in der Atmosphäre ist der Verlust des Methan in den Weltraum und die Methanaufnahme durch oxischen Böden (?Upland Soils?) die wichtigste Senke. In diesen Böden sind methanotrophe Bakterien aktiv. Ziel dieser Arbeit war es, die Zusammensetzung der methanotrophen Gilden in ?Upland Soils? quantitativ zu erfassen und die Aktivität der relevanten methanotrophen Taxa zu bestimmen. Weil bisher keine in ?Upland Soils? anwendbare, kultivierungs-unabhängige Methode zur Quantifizierung methanotropher Bakterien existierte, wurde in dieser Arbeit eine neue molekulare Methodik zur Quantifizierung entwickelt. Für methanotrophe Bakterien indikative Markergene wurden mit Real-time PCR quantifiziert. Als funktionelle Marker wurden Gene ausgewählt, die für Untereinheiten der Methan-Monooxygenasen kodieren (pmoA und mmoX) und die Phylogenie methanotropher Bakterien reflektieren. Anhand eines Vergleichs von Phylogrammen basierend auf diesen funktionellen Markergenen und Sequenzen des 16S rRNA-Gens wurden Gruppen methanotropher Gattungen abgeleitet (Hauptgruppen). Für diese Hauptgruppen wurden pmoA- oder mmoX-spezifische Real-time PCR Assays zur Quantifizierung dieser Gene entwickelt. SybrGreen diente dabei zur Detektion des gebildeten PCR-Produktes. Die Etablierung von 4-Schritt-Temperaturprofilen mit einem zusätzlichen Schritt zur Datenaufnahme ermöglichte Messgrenzen (³ 10 Zielmoleküle pro Reaktion), die vergleichbar mit Sonden-basierten Detektionssystemen wie z.B. TaqMan- oder Hybridisierungssonden waren. Auf diese Weise wurde eine quantitative Detektion von methanotrophen Bakterien anhand von Schlüsselenzymen möglich. Die Anwendung dieser Methodik an DNA-Extrakten aus Bodenproben ergab, dass mit Real-time PCR reproduzierbare Abundanzen methanotropher Hauptgruppen bestimmt werden konnten, die mit denen durch Kultivierungsmethoden bestimmte Abundanzen vergleichbar waren. Nach der Evaluierung dieser Methodik wurden zwei Waldböden in Deutschland untersucht, die Methan aus der Atmosphäre aufnahmen. MF war ein sandiger Boden mit saurem pH-Wert (4,3) auf Buntsandstein und GF ein toniger Boden mit neutralem pH-Wert (7,7) auf Muschelkalk. Grundsätzlich erwiesen sich beide Böden als aktiv hinsichtlich der Aufnahme von Methan (MF: 95[±32] mg CH4 m-2 d-1; GF: 50[±7] mg CH4 m-2 d-1). Übereinstimmend mit Befunden anderer Autoren wurden in beiden Böden die methanotrophe Hauptgruppen USC a (6,4[±0,2]x106 Zielmoleküle g-1 Boden [TG]) und USC g (11,6[±3,3]x106 Zielmoleküle g-1 Boden [TG]) nachgewiesen, die einen Anteil von mindestens 85 % an der jeweiligen methanotrophen Lebensgemeinschaft hatten und pmoA-Sequenzen von nicht-kultivierten methanotrophen Bakterien darstellten. Die zellspezifische Aktivität der Hauptgruppe USC a (17,1 x10-5 fmol Zelle-1 h-1) in Boden MF war trotz niedrigerer Gesamtabbundanz höher als die der Hauptgruppe USC g in GF (2,77x10-5 fmol Zelle-1 h-1). Dieser Aktivitätsunterschied spiegelte sich in der Tatsache wieder, dass nur mRNA des pmoA-Gens von USC a in Bodenproben gefunden wurde. Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse den Schluss zu, dass die detektierten Taxa an atmosphärische Methan-Konzentrationen angepasste ?hochaffine methanotrophe Bakterien? waren.