РАЗРАБОТКА НОВОГО МЕТОДА ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ С ПОМОЩЬЮ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОТ-ПЦР ЕДИНИЧНЫХ КЛЕТОК БЕЗ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК В СОЧЕТАНИИ С ЛАЗЕРНОЙ ЗАХВАТЫВАЮЩЕЙ МИКРОДИССЕКЦИЕЙ

摘要

Лазерная захватывающая микродиссекция (laser capture microdissection, LCM) в сочетании с количественной ОТ-ПРЦ представляется перспективным методом для анализа уровня экспрессии генов в интересующих типах клеток. Нами разработана методология, позволяющая избегать деградации РНК эндогенными и экзогенными РНКазами и целенаправленно выделять только изучаемые клетки. Мы комбинируем инактивацию экзогенных и эндогенных РНКаз реагентами RNaseZap и RNAIater с иммунофлуоресцентным мечением, и полученные таким образом меченые клетки в срезах используем на последовательных этапах LCM и ОТ-ПЦР в реальном времени. С помощью LCM меченные антителами нейроны захватываются на крышки микроцентрифужных пробирок, не содержащих РНКаз, и там же подвергаются лизису в 3%-ном растворе NP-40 без предварительного выделения РНК. Следующую стадию — обратную транскрипцию для синтеза кДНК — проводят in situ на поверхности крышки, чтобы избежать потерь РНК при переносе в пробирку. Используя этот протокол, мыоценили уровни мРНК иммуноглобулина G (IgG), фактора роста нервов (NGF) и GAPDH в небольшом числе захваченных нейронов. Таким образом, предлагаемый нами новый метод, в котором использована комбинация LCM и количественной ОТ-ПЦР без предварительного выделения РНК, представляется эффективным инструментом для анализа транскрипции интересующих генов в небольшом числе клеток, изолированных из предварительно обработанных реагентом RNAIater образцов тканей.