ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗНОЙ И НУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТЕЙ ДНК-ЗАВИСИМЫХ ПОЛИМЕРАЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИИ В РЕЖИМЕ РЕАЛ

摘要

Предложен новый способ оценки активности ферментов-полимераз с помощью флуоресцентной детекции в ходе изотермической реакции Метод позволяет одновременно определять ДНК-зависимую ДНК-поли-меразную и 5'-3'-экзонуклеазную активности с помощью амплификаторов с оптическим модулем для детекции флуоресценции в режиме реального времени, Проведено сравнение различных комбинаций прай-мер-матрица, используемых в качестве субстрата для полимераз.. Удлинение праймера (полимеразная реакция) детектируется по изменению флуоресценции красителя SYBR Green I при связывании с дцДНК, образующейся в ходе реакции, нуклеазные активности - по изменению флуоресценции в результате расщепления зонда, содержащего репортерный флуорофор и гаситель флуоресценции и предварительно гибридизо-ванного с одноцепочечным участком матрицы. Показана возможность использования метода для определения относительной активности препаратов ДНК-полимераз, для оценки гемпературно-временных параметров диссоциации комплексов полимеразы и специфических антител к ее активному цешру и анализа влияния ингибиторов и активаторов различной природы на скорость реакций полимеризации и 5'-,3'-экзо-нуклеазного расщепления полимеразой дцДНК. Метод также может использоваться для оценки эндонук-леазной активности ДНК-полимераз.