МОСТИКОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ -МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ФЕРМЕНТ-СУБСТРАТНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ И АЛЛЕЛЬСПЕЦИФИЧНОГО АНАЛИЗА ДНК

摘要

На примере широко используемых ДНК-зависимых ферментов - Т4 ДНК-лигазы и Taq ДНК-полимеразы - проведено систематическое исследование влияния положения и природы ненуклеотидной вставки в составе ДНК-комплексов на эффективность ферментативного превращения модифицированных субстратов. Субстратные комплексы формировали с использованием нативных и мостиковых олигонуклеотидов, несущих ненуклеотидные вставки на основе фосфодиэфиров ди-, тетра- или гексаэтиленгликоля, 1,5-пентан- и 1,10-декандиола, 3-гидрокси-2(гидроксиметил)-тетрагидрофурана. Установлено, что эффективность ферментативного превращения комплементарных комплексов существенно зависит от положения вставки: возмущение ДНК, удаленное от сайта ферментативного превращения, практически не сказывается на субстратных свойствах комплекса, нахождение вставки вблизи него значительно ухудшает их. С использованием серии модифицированных комплексов удается с точностью до 1-2 нуклеотидов локализовать сайт связывания на ДНК-субстрате каждого из исследованных ферментов. Показано, что наличие ненуклеотид-ной вставки приводит к увеличению эффективности дискриминации одиночных мисматчей в составе модифицированных комплексов относительно нативных как при лигировании олигонуклеотидов, так и при их удлинении.