Evaluation of a non-radioactive dot-blot nucleic acid hybridization as a detection tool for citrus leaf blotch virus in Cuba

摘要

Se evalu?3 un m??todo de hibridaci?3n de ??cidos nucleicos no radioactivo en formato dot-blot para la detecci?3n precisa de citrus leaf blotch virus (CLBV: Citrivirus) en extractos de ARN totales de ??rboles de c?-tricos. Los fragmentos de ADN que conforman parcialmente los marcos de lectura abiertos que codifican la polimerasa (RdRp), la prote?-na de movimiento (MP) y la prote?-na de la cubierta (CP) de CLBV se utilizaron para generar sondas marcadas con digoxigenina (DIG-11-dUTP) mediante PCR. Para generar las sondas se utilizaron fragmentos de ADN clonados a partir del aislado de CLBV de Cuba. Se evaluaron varias condiciones de trabajo que incluyeron el uso de diferentes membranas, soluciones de hibridaci?3n y tampones de lavado. Con el m??todo evaluado fue posible detectar hasta 40 pg de un plasmidio que contiene el genoma completo de CLBV, as?- como material gen?3mico del virus en extractos de ARN de plantas de kumquat 'Nagami' (Fortunella margarita) y kumquat 'Round' (F. japonica) infectadas de forma natural con el virus. Los resultados evidenciaron que el m??todo desarrollado es una herramienta ?otil y altamente recomendable, una vez sea validado, para su uso en los programas de saneamiento, cuarentena y certificaci?3n del material de propagaci?3n de c?-tricos en Cuba.