Unique features of the apoptotic endonuclease DFF40/CAD relative to micrococcal nuclease as a structural probe for chromatin

摘要

The gold standard for studies of nucleosomal chromatin structure for the past 30 years has been the enzyme micrococcal nuclease (MNase). During the course of our studies on the elucidation of the mechanism of action of the apoptotic nuclease DNA fragmentation factor-40 / caspase-activated deoxyribonuclease (DFF40/CAD) on naked DNA and chromatin substrates, it became clear that this enzyme is superior in certain respects to MNase for studying several aspects of chromatin structure. Here we review our published results supporting this statement. Relative to MNase, we have found that DFF40/CAD has the following properties: (i) it does not cut within nucleosomes to generate subnucleosomal DNA fragments; (ii) it is more specific for the linker regions between nucleosomes; (iii) it lacks exonuclease activity; (iv) it is specific for double-stranded DNA and makes exclusively double-stranded breaks; and (v) it attacks histone-H1-containing chromatin more efficiently. Taken together, these facts explain why DFF40/CAD generates sharper oligonucleosomal DNA ladders compared with those generated by MNase. We therefore recommend the following uses for DFF40/CAD for chromatin research: nucleosome isolation, chromatin-remodeling assays, repeat length measurements, and nucleosome-positioningassays along specific sequences. Other uses include footprinting assays of transcription factor positions, shearing chromatin for immunopreciptitation experiments (ChIP), and shearing DNA for recombinant DNA library preparation or for shotgun cloning for sequencing.L'outil de référence pour l'étude de la structure nucléosomale de la chromatine au cours des trente dernières années a été la nucléase micrococcale (MNase). Lors de nos travaux visant à élucider le mécanisme d'action de la nucléase apoptotique DFF40/CAD («DNA fragmentation factor-40/caspase-activated deoxyribonuclease») sur l'ADN nu et les substrats chromatiniens, il nous est apparu clairement que cette enzyme était supérieure à certains égard à la MNase pour étudier certains aspects de la structure de la chromatine. Nous passons en revue les résultats que nous avons publiés qui appuient cette affirmation. Par rapport à la MNase, nous avons trouvé que DFF40/CAD possède les propriétés suivantes : (i) elle ne coupe pas à l'intérieur de nucléosomes pour générer des fragments d'ADN subnucléosomaux; (ii) elle est plus spécifique aux régions de liaison entre les nucléosomes; (iii) elle n'a pas d'activité exonucléase; (iv) elle est spécifique pour l'ADN double-brin et inflige exclusivement des bris double-brins et (v) elle attaque plus efficacement la chromatine contenant l'histone H1. L'ensemble de ces faits explique pourquoi la DFF40/CAD génère des patrons d'oligonucléosomes en échelle plus fins que ceux générés par la MNase. Nous recommandons donc l'utilisation de la DFF40/CAD pour les fins de recherche sur la chromatine suivantes: isolement des nucléosomes, essais de remodelage de la chromatine, mesures des longueurs des unités de répétition ainsi que les essais de positionnement du nucléosome le long de séquences d'ADN spécifiques. D'autres utilisations incluent également des essais d'empreinte de position de facteurs de transcription, le cisaillement de la chromatine lors d'immunoprécipitation (ChIP) et le cisaillement d'ADN lors de la préparation de banque d'ADN ou pour du clonage aléatoire pour fins de séquence.