基于网络药理学及实验验证分析止得咳颗粒治疗咳嗽的作用机制

摘要

目的基于网络药理学预测止得咳颗粒治疗咳嗽的作用机制,并对其进行体内外实验验证。方法通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)与相关文献获取止得咳颗粒的活性成分及对应靶点;利用人类基因数据库(GeneCards)和比较毒物遗传学数据库(CTD)搜索咳嗽相关靶点;利用STRING数据库和Cytoscape软件构建止得咳颗粒与咳嗽交集靶点的蛋白质互作网络(PPI)网络;利用Cytoscape软件构建止得咳颗粒的“成分-靶点”网络和“成分-靶点-信号通路”网络;通过DAVID数据库对交集靶点进行通路注释和分析;运用SYBYL-X 2.0和Discovery Studio软件对止得咳颗粒排名靠前的活性成分和关键靶点进行分子对接,验证其生物活性;验证实验通过构建LPS致RAW264.7细胞炎症模型,CCK8法检测细胞增殖抑制率,酶联免疫吸附测定法(ELISA)和蛋白质印迹法(Western blot)检测炎症因子及相关蛋白表达,以及建立小鼠棉球肉芽肿模型,ELISA法检测棉球肉芽肿小鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达情况。结果研究共筛选出止得咳颗粒的活性成分59个,关键靶点11个,包括白细胞介素-6(IL-6)、前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)等靶点;功能分析和信号通路分析结果显示,止得咳颗粒主要涉及一氧化氮生物合成过程的正调控、氧化还原过程等生物过程,通过调节肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、百日咳信号通路、核因子κB(NF-κB)信号通路等信号通路产生作用。分子对接结果显示,鸢尾甲黄素A和PTGS2、异鼠李素和EGFR、柚皮素和MAPK3有比较高的结合活性。实验验证结果表明,止得咳颗粒浓度为12.5μg·mL^(-1)、25μg·mL^(-1)、50μg·mL^(-1)时对小鼠巨噬细胞(RAW264.7)没有毒性,不同浓度的止得咳颗粒可降低脂多糖(LPS)诱导RAW264.7细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6的释放,对环氧化酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白的表达也有抑制作用;止得咳颗粒能够减轻小鼠棉球肉芽肿的增生,降低小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达。结论本研究创新性的采用网络药理学方法结合实验验证初步探究止得咳颗粒治疗咳嗽的作用及作用机制,为后续深入研究其具体机制提供了理论基础。