阴沟肠杆菌WJ-1中甲氰菊酯降解酶基因pytZ的克隆、表达和重组酶特性研究

摘要

[目的]农药降解酶通常比农药降解菌更能耐受异常环境,具有更宽广的降解谱.为获得高产率和高质量的农药降解酶,在实验室前期获得阴沟肠杆菌WJ-1和证实具有农药降解酶基因pytZ的基础上,本研究拟将阴沟肠杆菌WJ-1农药降解酶基因pytZ重组表达于受体菌Escherichia coli BL21.并对重组菌农药降解酶的生理生化特性进行深入研究.[方法]通过PCR技术扩增获得阴沟肠杆菌WJ-1农药降解酶基因pytZ,构建pMD19重组质粒,再与pET-24a(K+)表达载体进行连接,构建基因工程菌E.co-li BL21/pET-24a(K+)-pytZ.将重组菌进行摇瓶培养.使用不同温度、pH值、IPTG浓度探讨重组酶酶促反应动力学参数.[结果]获取得到基因工程菌E.coli BL21/pET-24a(K+)-pytZ.30°C和IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L时,摇瓶培养48 h后可以获得最高的农药降解酶产量,酶活力达到15.3 U/mL.重组菌农药降解酶的酶促反应最优温度为35°C,25～ 45°C热稳定良好;重组菌农药降解酶的酶促反应最优pH值为8.0,pH 7.0～9.0酸碱稳定良好;重组菌农药降解酶对底物甲氰菊酯的反应动力学参数,米氏常数Km为0.076 mmol/L,最大反应速率Vmax为3.023 mmol/(L·min).[结论]利用基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-24a(K+)-pytZ生产得到更大量的甲氰菊酯降解酶,纯度更高,具有更好的温度和pH值适应性,反应动力学参数显示其降解效率更高.