紫花苜蓿MsCIPK2的克隆及功能分析

摘要

【目的】CIPK是植物响应逆境胁迫信号通路中一类重要的蛋白激酶,可与CBL形成CBL-CIPK复合物,启动细胞内相关应答基因的表达而应对各种非生物胁迫。发掘并研究紫花苜蓿MsCIPK基因响应非生物胁迫的分子机理,有助于揭示紫花苜蓿抗逆生物学基础,为紫花苜蓿抗逆育种提供新的基因资源。【方法】通过PCR技术克隆MsCIPK2,使用生物信息学工具分析基因序列,利用qRT-PCR技术分析MsCIPK2,以及与其互作的4个CBL基因(MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10)在紫花苜蓿各组织中的表达水平,在烟草叶片表皮细胞中,瞬时表达pCAMBIA1302-GFP-MsCIPK2融合表达载体,通过激光共聚焦显微镜观察进行亚细胞定位,利用酵母双杂交技术分析MsCIPK2与4个MsCBLs蛋白互作情况,利用发根农杆菌诱导紫花苜蓿产生过量表达MsCIPK2的毛状根,利用qRT-PCR技术分析转基因毛状根株系中相关基因的表达水平。【结果】通过PCR扩增获得MsCIPK2片段,该基因CDS为1 230 bp,编码409个氨基酸,具有典型的CIPK家族的ATP结合位点、激活环、NAF motif和PPI motif等结构域。MsCIPK2在紫花苜蓿根中表达量最高,在花中表达量最低。亚细胞定位结果显示,MsCIPK2蛋白定位于内质网。酵母双杂交试验结果显示,MsCIPK2蛋白与MsCBL2、MsCBL6、MsCBL7和MsCBL10蛋白具有相互作用,且与MsCBL10蛋白相互作用较强。MsCBL2、MsCBL6和MsCBL10在紫花苜蓿根中表达量最高,MsCBL7在荚中表达量最高。qRT-PCR结果表明,过量表达MsCIPK2的毛状根中响应非生物胁迫基因ATPase、P5CS、CYP705A5、COR47、HAK5和RD2的表达量均明显上调。在200 mmol·L^(-1)NaCl和20%PEG处理条件下,与对照相比,过量表达MsCIPK2毛状根的丙二醛含量降低,SOD活性、脯氨酸含量和可溶性糖含量增高。【结论】紫花苜蓿MsCIPK2与MsCBLs蛋白互作,主要在根中表达并响应盐和干旱胁迫,过量表达MsCIPK2可以提高紫花苜蓿的耐盐性和耐旱性,MsCIPK2可作为提高紫花苜蓿抗逆育种的候选基因。