牙龈卟啉单胞菌脂多糖对活性中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响

摘要

目的:探讨牙龈卟啉单胞菌(P.gingivalis)脂多糖(LPS)对活性中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)形成的影响及可能的调控机制。方法:采用25 ng/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和0.3μg/mL P.gingivalis LPS刺激人中性粒细胞35 min,免疫荧光显微镜下观察活性NETs的形成,酶标法对胞外DNA定量,PCR法检测构成NETs的DNA来源。检测产生活性NETs的中性粒细胞感染P.gingivalis后胞内外的细菌数量,以明确NETs的杀菌效果;流式细胞术检测细胞产生的活性氧(ROS)水平;Western blot检测丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Raf)、丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)和细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)的磷酸化水平。结果:GM-CSF+P.gingivalis LPS可促进线粒体DNA来源的活性NETs形成和胞外DNA数量的增加(P<0.05),增强中性粒细胞对P.gingivalis的杀菌活性(P<0.05)。与阴性对照组相比,GM-CSF+P.gingivalis LPS刺激的中性粒细胞ROS和Raf、MEK、ERK磷酸化水平均明显增高(P<0.05)。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶抑制剂DPI处理后,GM-CSF+P.gingivalis LPS组胞外DNA数量降低,ROS水平降低(P<0.01)。结论:GM-CSF+P.gingivalis LPS可能通过Raf、MEK、ERK磷酸化调控ROS生成,促进人中性粒细胞形成活性NETs,进而促进P.gingivalis的清除,调控牙周免疫炎症反应。