肠出血性大肠杆菌毒力因子Z1444的原核表达及其丝/苏氨酸激酶活性验证

摘要

目的:在大肠杆菌中表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)毒力岛上的毒力因子Z1444并纯化,对其丝/苏氨酸激酶活性进行初步检测.方法:根据GenBank中Z1444基因序列及pET-28a(+)载体的多克隆位点设计引物,以EHECO157:H7全菌裂解液为模板,经PCR钓取1047 bp的目的片段,与表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-Z 1444,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导蛋白表达并经SDS-PAGE鉴定,利用体外反应体系鉴定重组蛋白的丝/苏氨酸激酶活性.结果:双酶切和测序鉴定表明,pET-28a(+)-Z 1444原核表达质粒构建正确;诱导表达后经纯化,获得纯度在90％以上的可溶性重组Z1444,相对分子量约为38×103;体外酶活实验验证了Z1444的丝/苏氨酸激酶活性.结论:Z1444在大肠杆菌中获得高效可溶性表达,为后续功能验证奠定了基础.