甲型H1N1流感病毒RNA检测方法的建立及临床应用

摘要

目的 建立检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并探讨其临床应用价值.方法 根据甲型H1N1流感病毒HA基因和NA基因的核苷酸序列和GenBank数据库中的核苷酸序列设计检测特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系和反应条件,建立检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行评价.采用该方法检测21份鼻咽拭子样本的甲型H1N1流感病毒RNA,并与鸡胚培养法进行比较.结果 采用实时荧光定量RT-PCR检测甲型H1N1流感病毒RNA结果为阳性,H1～H16流感病毒、季节性流感病毒、猪流感病毒RNA检测结果均为阴性.实时荧光定量RT-PCR的检测敏感性为103拷贝/μL RNA分子,标准曲线r2=0.998.阳性RNA标准品重复检测的循环阈值(Ct)批内、批间变异系数(CV)均<10％,阴性标准品[焦碳酸二乙酯(DEPC)水]重复检测的Ct值均<0,重复性良好.21份鼻咽拭子样本中有2份样本甲型H1N1流感病毒检测结果为阳性,其他样本均为阴性,与鸡胚培养法的符合率为100％.结论 建立的检测甲型H1N1流感病毒RNA的实时荧光定量RT-PCR方法操作简单、耗时短、特异性较强、敏感性较高,可在临床广泛使用.