金黄色葡萄球菌荧光定量PCR检测方法的建立及其在大鼠、小鼠粪便检测中的应用

摘要

目的建立一种快速灵敏的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)检测方法。方法选择金黄色葡萄球菌特异性基因nuc作为靶基因,设计并合成一对特异性引物和一条TaqMan探针,利用荧光定量PCR技术建立nuc基因的核酸检测方法,并在大鼠、小鼠粪便样本检测中进行应用。结果对金黄色葡萄球菌和其他非金黄色葡萄球菌菌株中提取的DNA进行荧光定量PCR检测,结果显示金黄色葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非金黄色葡萄球菌未出现,表明设计的引物和探针对金黄色葡萄球菌检测具有特异性。将提取的金黄色葡萄球菌DNA进行10倍梯度稀释后测定其灵敏度,结果显示最低检出限是10 fg的DNA量,比普通PCR方法高2个数量级。本研究共检测91份样品,有4份来自同一设施的大鼠样品,扩增曲线为典型的S曲线;将该PCR产物测序并进行BLAST比对,该样本的基因序列与金黄色葡萄球菌的基因序列相似度为100%,表明该样本为金黄色葡萄球菌nuc基因核酸阳性,阳性率为4.40%,与细菌培养法的检测结果一致。核酸提取采用全自动核酸纯化仪,从核酸提取到检测结果判定快速,所需时间小于1.5 h。结论建立的以nuc为靶基因鉴定金黄色葡萄球菌的qPCR方法,具有快速、灵敏度高和特异性强的优点,可用于实验动物大鼠、小鼠粪便中金黄色葡萄球菌的检测。