三角褐指藻PPDK基因RNAi载体的构建和基因枪转化

摘要

三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）的全基因组序列已经公布,为了把RNAi的技术应用于三角褐指藻的相关研究中,以C4途径关键酶丙酮酸磷酸二激酶基因（PPDK）为试验对象,构建了用于表达与PPDK部分序列同源的发夹RNA（hpRNA）的载体pPPDKi,并用基因枪方法成功将PPDKi和Zeocin抗性基因sh ble共转化到三角褐指藻细胞中.摸索出的较优基因枪转化的条件为：使用50%海水f/2培养基预培养的藻进行微粒轰击,轰击压力10.5 MPa,钨粉直径1.0μm,轰击距离6.5 cm.PCR检测结果表明,在Zeocin筛选的阳性藻株中约有60%同时整合了PPDKi序列.将其中6株共转化的转基因藻与野生型藻的生长速率进行比较,发现它们的生长受到4.6%~10.7%的抑制.这可能是PPDKi的表达影响了丙酮酸磷酸二激酶（PPDK）的活性,从而进一步影响了三角褐指藻的生长,但也有可能是外源片段的插入影响了其他基因的正常表达,导致细胞活动异常.