Klenow大片段聚合酶及T_4DNA聚合酶在构建重组质粒中的应用

摘要

利用大肠杆菌Klenow大片段聚合酶5′→3′聚合酶活性和T4DNA聚合酶3′→5′外切酶特性构建植物高效表达载体pBLT35Svp4-ST。用pUC18-435S中的T35S启动子取代植物表达载体pBLG-VP4-ST中的双35S启动子,通过Klenow大片段的聚合酶活性对植物表达载体pBLG-VP4-ST中的HindⅢ3′凹端补平,再利用T4DNA聚合酶外切酶活性将质粒pUC18-435S的四倍35S启动子即T35S中的SacⅠ3′凸端削平。在T4DNA连接酶作用下将一端为平端,另一端为BamHⅠ的粘性末端的四倍35S启动子定向连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中取代原有的双35S启动子,转化并筛选阳性克隆。结果经PCR和酶切鉴定证实,四倍35S启动子成功连接到植物表达载体PBLG-VP4-ST中。