来氟米特通过调节miR-449a在肺纤维化中的机制研究

摘要

目的探究来氟米特(leflunomide,LEF)通过调节微小RNA(microRNA,miR)-449a在肺纤维化中的机制研究。方法将人肺成纤维细胞MRC-5分为6组,即对照组、LEF组、LEF+mimic组、mimic组、LEF+inhibitor组和inhibitor组。通过质粒转染miR-449a mimic或inhibitor来过表达或沉默miR-449a,在5 mg/L LEF的条件下培养48 h。分别通过CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测各组细胞活力、细胞增殖能力和凋亡率。使用免疫荧光染色检测α平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin,α-SMA)胶质蛋白I(collagen I,col I)。分别使用qPCR和Western blot检测miRNA和蛋白的水平。结果 mimic组miR-449a水平显著高于对照组(P<0.05)。LEF组和inhibitor组的miR-449a水平显著低于对照组(P<0.05)。LEF+mimic组的miR-449a的表达水平显著高于LEF组,LEF+inhibitor组的miR-449a水平显著低于LEF组(P<0.05)。LEF组和inhibitor组的细胞活力和细胞增殖能力显著高于对照组(P<0.05)。mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于对照组(P<0.05)。LEF+mimic组的细胞活力和细胞增殖能力显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的细胞活力显著高于LEF组(P<0.05)。LEF组和inhibitor组的细胞凋亡率低于对照组(P<0.05),mimic组的细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05)。LEF+mimic组的细胞凋亡率显著高于LEF组而LEF+inhibitor组的凋亡率显著低于LEF组(P<0.05)。LEF组和inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白的荧光强度显著高于对照组(P<0.05),mimic组的相对荧光强度低于对照组(P<0.05)。LEF+mimic组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著低于LEF组,LEF+inhibitor组的α-SMA和Col I蛋白相对荧光强度显著高于LEF组(P<0.05)。LEF组和inhibitor组的p-JNK/JNK水平高于对照组(P<0.05),mimic组的p-JNK/JNK水平显著低于对照组(P<0.05),LEF+mimic组中p-JNK/JNK水平显著低于LEF组而LEF+inhibitor组的p-JNK/JNK水平显著高于LEF组(P<0.05)。结论 LEF可能通过抑制肺成纤维细胞中miR-449a的表达激活JNK途径,从而诱导成纤维细胞的活化和增殖,抑制其凋亡,从而引起肺纤维化。