精子特异性锌指蛋白146条件性敲除小鼠的构建及鉴定

摘要

目的 探讨构建精子特异性RNF146敲除小鼠及其鉴定方法.方法 从NCBI网站上检索小鼠RNF146的基因序列,分析外显子与各剪接体的关系以及起始密码子和终止密码子所在区域,选择条件性基因敲除片段.构建基于Cre/LoxP系统的RNF146条件性敲除杂合子(RNF146flox/+)小鼠(F1代).取F1代RNF146flox/+杂合子小鼠自交,PCR鉴定其后代基因型,挑选RNF146纯合子敲除(RNF146flox/flox)雌鼠与精子特异性Cre转基因雄鼠AQP2-Cre进行杂交.PCR检测其后代基因型,选取AQP2-Cre阳性的RNF146杂合子雄鼠(AQP2-Cre;RNF146flox/+)与RNF146纯合子(RNF146flox/flox)雌鼠回交后筛选AQP2-Cre阳性的RNF146纯合子小鼠(AQP2-Cre;RNF146flox/flox)即为精子特异性RNF146敲除小鼠.选取9～10周龄(体成熟)的精子特异性RNF146敲除小鼠,从附睾和输精管中分离精子,以AQP2-Cre;RNF146flox/+小鼠为对照,Real-time PCR及Western blot分析精子中RNF146表达水平确认敲减效率.结果 RNF146基因四号外显子被选为敲除区域来构建基于Cre/LoxP系统的条件性敲除小鼠.F1代杂合子(RNF146flox/+)小鼠自交后代中约1/4个体为RNF146flox/flox;AQP2-Cre转基因工具鼠与纯合子(RNF146flox/flox)雌鼠交配后代中具有AQP2-Cre;RNF146flox/+基因型的小鼠约占1/2;AQP2-Cre;RNF146flox/+雄鼠和RNF146flox/flox雌鼠交配后代中近1/4为AQP2-Cre;RNF146flox/flox小鼠.成年AQP2-Cre;RNF146flox/flox小鼠精子中RNF146 mRNA(Real-time PCR)和蛋白表达水平(Western blot)分别降低77.3％(P<0.001)和89.2％(P<0.001).结论 成功构建精子特异性RNF146条件性敲除小鼠AQP2-Cre;RNF146flox/flox.