衰老表型肝细胞外泌体对脂多糖致炎软骨细胞的影响及白芍的干预效应

摘要

目的 研究衰老表型的肝细胞外泌体对脂多糖(LPS)刺激软骨细胞的影响及白芍的干预效应.方法 提取小鼠肝原代细胞,CCK-8法筛选白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度.随后,肝细胞随机分为空白组、衰老组和白芍组,0.3 mmol·L-1过氧化氢诱导肝细胞衰老,检测肝细胞p16、p21、p53的基因和蛋白表达,观察肝细胞衰老及白芍的干预效应.分别提取各组肝细胞上清中的外泌体,通过电镜、粒径分析、四旋蛋白CD9、CD63、CD81鉴定外泌体.培养小鼠软骨细胞,LPS刺激以模拟KOA炎症环境,检测细胞上清液中TNF-α和IL-1β含量以验证造模成功.PHK67染色标记肝细胞外泌体并观察软骨细胞的摄入情况.将收集的各组肝细胞外泌体用于干预LPS致炎软骨细胞,检测软骨细胞基质降解合成标记物MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的基因和蛋白表达水平.结果 经CCK-8法筛选,100 μg·mL-1为白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度.过氧化氢干预后,衰老组中细胞衰老标记物p16、p21、p53的基因和蛋白表达均高于正常组(P＜0.05),而在白芍组则较衰老组降低(P＜0.05).各组肝细胞所收集外泌体均呈现双层膜结构,形态大小无差异,粒径富集均满足40～120 nm区间,代表性粒径富集于116.8 nm,丰度98％,外泌体标记物四旋蛋白CD9、CD63、CD81均为阳性表达.软骨细胞上清液中,促炎因子TNF-α、IL-1β的含量均在LPS刺激后较刺激前升高(P＜0.01),PHK67染色试剂确认软骨细胞对各组肝细胞外泌体的摄入.衰老组肝细胞外泌体的干预下,软骨细胞基质降解合成标记物MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的基因和蛋白表达水平均较空白组肝细胞外泌体干预升高(P＜0.05),而白芍组肝细胞外泌体干预则较衰老组肝细胞外泌体干预降低(P＜0.05).结论 衰老表型肝细胞外泌体可加剧LPS致炎软骨细胞的退变进程,白芍水煎剂对此环节存在良性干预.