利用双引导RNA的CRISPR/Cas9技术构建Nudt3基因敲除小鼠

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术构建Nudix水解酶家族成员核苷二磷酸连接的部分X基序3[Nudix(nucleotide diphosphate linked moiety X)-type motif 3,Nudt3]基因敲除C57BL/6小鼠模型。方法:根据CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,在Nudt3基因第2个外显子位置及第2个外显子与第3个外显子间的区域分别设计2个引导RNA(guide RNA,gRNA),结合早期胚胎显微注射技术构建生殖系基因编辑嵌合体小鼠,并从中筛选出合适的基因敲除小鼠。在此基础上,采用反转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术验证Nudt3基因在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以较高效率获得了F0代基因编辑小鼠,通过繁育获得了F1代杂合子小鼠和F2代纯合子小鼠。RT-PCR和Western blot检测结果显示,F2代纯合子小鼠的若干代谢调控组织(如肝脏、下丘脑等)中均无Nudt3基因表达。结论:Nudt3基因敲除小鼠构建成功,为下一步的代谢表型鉴定以及机制研究提供了理想的动物模型。