齿毛菌漆酶的基因克隆、异源表达及脱色研究

摘要

通过简并PCR、TAIL-PCR、SiteFinding PCR等方法从实验室前期筛选得到的一株齿毛菌中获得漆酶Lac基因（包括启动子）序列,将其cDNA转入Pichia pastoris X33中表达,以ABTS（2,2-azinobis-（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid））为底物测定温度和pH对酶活及其稳定性的影响,并探究重组漆酶的脱色效果.结果表明,Lac DNA长3 129 bp,含有10个内含子,编码的Lac蛋白共有542个氨基酸,与已知漆酶氨基酸序列的相似性最高为60％,在5’端950 bp序列内发现多个可能的启动子元件;成功分泌表达重组漆酶rLac,在含1 mmol·L-1铜离子的YP培养基中28℃发酵15 d达到酶活最高峰2.89 U·mL-1;酶学性质研究发现,rLac的最适作用温度和pH值分别为55℃和3.0,且在pH 4～10及20 ～ 40℃有较好的稳定性;rLac对靛类、偶氮类、三苯甲烷类等多种染料都有脱色效果.