一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体

摘要

利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术可以进行基因功能研究以及作物遗传改良,但常规构建RNAi载体方法费时费力.本研究报道了一种基于USER酶一步法快速构建RNAi发夹结构的载体2301/RNAi/OS及其应用方法,操作简便,省时省力.与已报道的利用酶切连接、Gateway兼容的同源重组或PCR直接连接等构建RNAi载体相比,该载体不需要酶切片段,片段扩增完成后即可与制备好的线性化载体进行反应,缩短操作流程和时间,提高成功率;该载体对插入片段的酶切位点和长度没有要求,理论上任何位置和长度的片段均可进入2301/RNAi/OS载体中,尤其是长片段RNAi的构建.本试验以本氏烟(Nicotiana benthamiana)PDS(Phytoene desaturase)基因为例,利用农杆菌介导的瞬时表达体系验证了该RNAi能够在植物体内有效地实现基因沉默.该载体以新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)作为筛选标记基因,可以利用卡那霉素(Kanamycin)和G418(Geneticin)等抗生素筛选转基因阳性植株,适合单子叶和双子叶植物的遗传转化.