慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8+T细胞的线粒体代谢功能影响CAR-T细胞效能的体外试验研究

摘要

目的通过体外试验探究慢性淋巴细胞白血病细胞损害CD8+T细胞的线粒体代谢功能影响嵌合抗原受体的T淋巴细胞（chimeric antigen receptors modified T cells, CAR-T）的效能。方法将培养得到的CAR-T细胞和CD8+T细胞作为正常组, 感染组为加入慢性淋巴细胞白血病细胞进行侵染的CAR-T细胞和CD8+T细胞。采用FACScan流式细胞仪检测CAR-T细胞的凋亡情况;Western blot检测细胞凋亡相关的蛋白Bcl-2、cleaved-caspase-3和Bax的相对表达量;酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）检测炎症因子肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor-alpha, TNF-α）、白细胞介素（interleukin, IL）-6和IL-10的变化;使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度;化学发光发检测细胞内三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）水平, 分光光度计检测线粒体丙二醛（malondialdehyde, MDA）、还原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）的含量;荧光探针法检测胞内钙离子浓度的变化, 实时荧光定量PCR检测线粒体DNA表达水平的变化。结果正常组CAR-T细胞凋亡率显著低于感染组CAR-T细胞凋亡率, 差异有统计学意义[（4.58±0.16）%比（7.06±0.74）%, χ2=5.674, P＆0.05]。感染组的Bax和cleaved-PARP表达量明显高于正常组, Bcl-2表达量明显低于正常组, 差异具有统计学意义[（3.51±0.01）%比（1.07±0.01）%, （2.34±0.05）%比（1.36±0.04）%, （0.66±0.02）%比（1.17±0.02）%, χ2值分别为298.838, 26.509和31.231, P值均＆0.05]。感染组的IL-6、TNF-α表达量较正常组明显升高, IL-10表达量较正常组明显降低, 组间差异具有统计学意义[（87.69±21.07）ng/L比（43.25±5.36）ng/L, （65.12±15.75）ng/L比（33.14±5.23）ng/L, （16.02±1.69）ng/L比（24.33±2.33）ng/L, t值分别为3.54, 3.338和4.988, P值均＆0.05]。感染组的ATP和总钙离子浓度低于正常组, 差异具有统计学意义[（0.15±0.03）μmol/g比（0.32±0.06）μmol/g, （12.46±2.74）μmol/L比（25.97±3.49）μmol/L,t值分别为4.389和5.274, P值均＆0.05]。感染组的MDA含量高于正常组, GSH含量低于正常组, 差异具有统计学意义[（1.84±0.23）μmol/L比（1.34±0.21）μmol/L, 1.07±0.17)pg/mg比（5.23±0.36）pg/mg, t值分别为2.781和18.098, P值均＆0.05]。感染组CD8+T细胞线粒体基因蛋白的表达量明显低于正常组, 差异具有统计学意义[（0.62±0.03）%比（1.01±0.06）%,χ2=10.070, P＆0.05]。结论离体状态下慢性淋巴细胞白血病细胞通过损害CD8+T细胞的线粒体代谢功能促进CAR-T细胞的凋亡。