应用CRISPR/Cas9技术制备Sema4D基因条件性敲除小鼠模型

摘要

目的:利用CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated 9)基因编辑技术使用C57BL/6J小鼠建立Sema4D基因条件性敲除小鼠模型,为Sema4D基因在哮喘中扮演的角色和作用机制的研究提供实验基础.方法:根据Sema4D基因第4外显子碱基序列,设计针对Sema4D基因的gRNA(guide RNA),构建gRNA表达质粒,将体外转录gRNA、Cas9 mRNA和含有loxP位点的供体载体对C57BL/6J小鼠的受精卵进行显微注射,产生目标基因敲除子代,待小鼠出生后1周左右剪小鼠脚趾进行PCR鉴定和序列分析,所获F0代founder小鼠继续与野生型小鼠合笼繁殖获取F1代小鼠,1周左右后剪取组织送检PCR.将F1靶向flox杂合小鼠与组织特异性Sftpc-CreERT2工具鼠杂交,生成F2代小鼠,该F2代小鼠对于目标等位基因是杂合的,而对于Cre转基因是阳性的.F2代自交扩繁后得到F3代的CKO(flox/flox,Sftpc-CreERT2)纯合子雄性小鼠和flox/+、flox/flox、flox/+Sftpc-CreERT2雌性小鼠交配后,得到F4代CKO小鼠.再经他莫昔芬的诱导敲除目标条件基因后,qPCR检测mSema4D的含量确认目标基因是否敲除成功.结果:获得F4代CKO敲除小鼠,qPCR结果显示经他莫昔芬诱导后获得正确的Sema4D基因条件性敲除小鼠模型.结论:成功建立C57BL/6J小鼠Sema4D条件性敲除模型,为研究Sema4D表达缺失与哮喘气道免疫炎症的相关性提供了重要工具.