绵羊皮肤前体细胞体外分离培养及特征鉴定

摘要

本研究建立绵羊皮肤前体细胞(skin-derived precursor cells,SKPs)体外快速分离方法,为体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)技术提供理想的供体细胞。试验采用组织块贴壁法从绵羊耳组织中分离获得成纤维细胞;P3代成纤维细胞通过汉克斯平衡盐(Hanks’Balanced Salt Solution,HBSS)(pH=5.7)进行急性酸胁迫处理15 min获得SKPs并命名为pH-SKPs;采用RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)、免疫荧光技术和测定生长曲线对成纤维细胞和pH-SKPs进行鉴定;此外,在含15%FBS的杜氏改良Eagle培养基—高葡萄糖(DMEM-high glucose,DMEM)中诱导pH-SKPs分化为成纤维细胞,以验证pH-SKPs的分化潜能。结果显示组织块贴壁法获得的绵羊成纤维细胞呈典型的梭形;RT-PCR检测发现细胞中表达成纤维细胞特异性基因Vimentin;免疫荧光检测发现细胞中成纤维细胞标志蛋白纤粘蛋白(fibronectin)和波形蛋白(vimentin)呈阳性表达,表明分离的细胞具有成纤维细胞特性。酸胁迫处理成纤维细胞获得的pH-SKPs呈球形并悬浮生长;RT-PCR检测发现细胞中表达多能性标记基因NANOG、OCT4和SOX2,神经嵴标记基因PAX3和Nestin以及成纤维细胞标志基因Vimentin;免疫荧光检测发现细胞中干细胞标志蛋白SOX2、NANOG和OCT4呈阳性表达,表明pH-SKPs具有干细胞特性;pH-SKPs中巢蛋白(nestin)、Vimentin、Fibronectin和平滑肌蛋白(smooth muscle actin,SMA)呈阳性表达,表明其具有分化为神经元、成纤维细胞和平滑肌细胞的潜能。成纤维细胞和pH-SKPs的生长基本符合S型生长规律。pH-SKPs分化后的细胞表达Vimentin基因和标志蛋白Vimentin,表明其具有分化为成纤维细胞的特性。本研究成功应用急性酸胁迫处理绵羊成纤维细胞获得pH-SKPs,为绵羊SCNT研究提供理想的供体细胞。