肾素-NADPH氧化酶-活性氧通路对肾素(原)受体介导的大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

摘要

目的以NOX-1为研究对象,进一步观察NOX-1介导的活性氧(reactive oxygen species,ROS)通路在肾素(原)受体[(pro)re-nin receptor,(P)PR]介导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖中的作用。方法实验分两部分:(1)探讨DPI(NADPH氧化酶抑制剂)对肾素促VSMC增殖、Cyclin D1及PCNA表达的影响,实验分以下7组:①空白组;②对照组(Control+Los+PD123319);③肾素10-10+Los+PD123319组;④肾素10-9+Los+PD123319组;⑤肾素10-8+Los+PD123319组;⑥肾素10-9+DPI+Los+PD123319组;⑦DPI+Los+PD123319组。(2)探讨(P)PR在肾素诱导的氧化应激中的作用,实验分以下6组:①空质粒转染组;②对照组(空质粒转染+Los+PD123319);③肾素组;④(P)PR干扰+肾素组;⑤血小板源生长因子BB(PDGF-BB)组;⑥(P)PR干扰+PDGF-BB组。实验结束后,分别采用流式细胞术检测各组细胞ROS含量及细胞周期,黄嘌呤氧化酶法测定各组细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力;TBA法测定各组细胞丙二醛含量;Real-time PCR法检测各组CyclinD1、PCNA和NOX-1 mRNA表达;Western Blotting法检测CyclinD1、PCNA和NOX-1蛋白表达。结果①与对照组比较,不同浓度肾素处理细胞后细胞平均荧光强度值显著升高(均P<0.05),呈浓度依赖性。与10-9mol/L肾素组比较,肾素10-9+DPI+Los+PD123319组平均荧光强度值显著降低(P<0.05)。②与对照组比较,给予肾素处理后细胞丙二醛显著升高,而SOD水平显著降低,呈浓度依赖性(均P<0.05);与肾素组比较,加入DPI可抑制肾素促进的丙二醛水平升高和SOD水平降低(均P<0.05);与对照组比较,给予PDGF-BB处理后,细胞丙二醛水平显著升高,SOD水平显著下降(均P<0.05),将(P)RR-miRNA干扰质粒转染入VSMC后可以抑制PDGF-BB和肾素的作用(P<0.05)。③细胞周期结果表明,与对照组比较,肾素处理组G1期构成比显著降低,S期构成比及增殖指数显著升高(均P<0.05);而与肾素处理组比较,给予DPI处理后,发现DPI可以抑制肾素的作用(均P<0.05)。④Real-time PCR和Western Blotting结果显示,与对照组比较,不同浓度的肾素处理VSMC后PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达显著升高,呈浓度依赖性(均P<0.05);而与肾素处理组比较,给予DPI处理后,DPI可以抑制肾素促进PCNA、Cyclin D1 mRNA和蛋白表达升高的作用(均P<0.05)。⑤与对照组比较,肾素和PDGF-BB可促进NOX-1 mRNA和蛋白的表达(均P<0.05),将(P)RR-miRNA干扰质粒转染入VSMC后可抑制肾素和PDGF-BB的这种作用(均P<0.05)。结论肾素通过NADPH氧化酶-ROS通路促进大鼠血管平滑肌细胞的增殖及Cyclin D1和PCNA表达。