用双拷贝逆转录病毒载体转导人G－CSF　cDNA的实验研究

摘要

为克服逆转录病毒中内部启动子对插入外源基因表达的干扰，将人Ｇ－ＣＳＦ（粒细胞集落刺激因子）ｃＤＮＡ插入双拷贝载体Ｎ２Ａ的３＇ＬＴＲＵ３区上的多克隆位点，酶切鉴定后将重组质粒用电击转导法转入Ｐｓｉ－２嗜单性包装细胞系，经Ｇ－４１８选择压力，两周后挑出阳性克隆，测定感染滴度后转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，选择挑出抗性克隆，测定Ｇ－ＣＳＦ表达量，最高达５３．３Ｕ／１０６细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析证明嵌合的目的基因在感染细胞中通过基因复制而转染到５＇ＬＴＲ的转录单位之外并且在染色体ＤＮＡ中稳定整合，复制产生两个拷贝，在３＇ＬＴＲ和５＇ＬＴＲ中各有一个基因。