丹参功能基因组学研究Ⅰ——cDNA芯片的构建

摘要

目的:构建丹参cDNA芯片,为基因表达谱研究提供条件。方法:采用CTAB法提取丹参根总RNA,采用Pharmacia公司QuichprepTMMicro mRNA Purifi Cation Kit分离mRNA后,通过在cDNA分子两端加上EcoRⅠ/NotⅠ接头,在T4多核苷酸激酶的作用下磷酸化,与表达载体λZAP Express Predigested Vector连接,然后用包装蛋白在体外包装连接产物,感染E.coliXL1-Blue MRF’构建成cDNA文库。挑取分离良好的噬菌斑进行PCR扩增,经过电泳检测、纯化、再次电泳检测后得到的克隆用于芯片点制。以丹参actin基因作为阳性对照,不含DNA的点样液和Poly A为阴性对照。结果:cDNA文库插入片段长度为500～2 500 bp。共得到4 354个克隆用于芯片点制。单色荧光(Cy3)杂交显示,阳性对照均出现杂交信号,阴性点没有杂交信号。整张芯片背景清晰,漏点少,杂交点为完整的圆形,芯片质量完好。结论:该芯片的制作为首张有关道地药材的cDNA芯片,为丹参功能基因组的研究提供了强有力的工具。