伏毛铁棒锤DNA分离及ISSR-PCR体系优化

摘要

为了获得伏毛铁棒锤稳定可靠的ISSR-PCR反应体系,本研究对总DNA提取的CTAB法进行改良,并采用正交试验设计方法,对影响伏毛铁棒锤ISSR-PCR扩增结果的Taq DNA聚合酶、Mg^(2+)、dNTP、引物、模板DNA五个因素进行优化。在此基础上筛选多态性好的ISSR引物,并用梯度法确定各个引物的最适退火温度。结果显示:改良CTAB法所提DNA的质量和纯度高;伏毛铁棒锤20μL ISSR-PCR最佳反应体系为:0.6 U Taq DNA聚合酶,1.5mmol/LMg^(2+),0.125mmol/LdNTP,0.5μmol/L引物,30 ng模板DNA;以最佳反应体系为基础,从ISSR引物(UBC801~UBC900)中筛选获得12条多态性好的ISSR扩增引物,并确定了各引物的最适退火温度。该最佳反应体系能在伏毛铁棒锤不同样品中扩增出清晰且重复性好的条带,可用于后续伏毛铁棒锤遗传多样性的研究。