氟咯草酮对小鼠睾丸及TM4细胞凋亡和Nrf2/HO-1及NFκB信号通路的影响

摘要

[背景]氟咯草酮(FLC)具有雄性生殖毒性,可引起氧化应激状态下睾丸组织及支持细胞凋亡,核因子红细胞2相关因子2/血红素加氧酶-1(Nrf2/HO-1)信号通路以及核因子κB(NFκB)信号通路是否在该过程中发挥作用值得关注。[目的]观察FLC体内/外染毒小鼠睾丸组织及小鼠睾丸支持细胞系TM4细胞对细胞凋亡及Nrf2/HO-1和NFκB信号通路的影响。[方法](1)动物实验。获取雄性C57BL/6小鼠FLC(染毒剂量为每日0、3、15、75和375 mg·kg^(-1))经口染毒28 d后睾丸组织样本;通过比色分析睾丸组织匀浆中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,观察睾丸组织氧化应激水平,TUNEL染色观察睾丸组织凋亡情况,免疫组化观察Nrf2、NFκB的表达及分布,Western blotting检测睾丸组织匀浆中Nrf2、HO-1、醌NADH脱氢酶1(NQO1)、NFκB、NFκB抑制因子激酶β(IKKβ)、磷酸化NFκB抑制因子α(P-IκBα)蛋白表达水平。(2)细胞实验。40、80、120、160、200μmol·L^(-1)FLC对TM4细胞系染毒6 h,CCK-8细胞计数,试剂盒检测细胞活力。40、80、160μmol·L^(-1)FLC染毒6 h,通过流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting检测Nrf2、HO-1、NQO1、NFκB、IKKβ、IκBα蛋白表达水平。[结果](1)动物实验。雄性C57BL/6小鼠经口FLC染毒28 d后,生精小管间质及基底部发生细胞凋亡。与对照组相比,375 mg·kg^(-1)FLC染毒组睾丸组织中MDA含量明显升高(P<0.05),SOD活性明显下降(P<0.05)。375 mg·kg^(-1)FLC染毒后生精小管间质及基底部发生细胞凋亡。免疫组化结果显示染毒组生精小管间质及基底部Nrf2、NFκB表达。与对照组相比,Nrf2、NQO1、P-IκBα、NFκB、IKKβ蛋白水平在15、75、375 mg·kg^(-1)组均明显升高(P<0.001),HO-1蛋白水平在375 mg·kg^(-1)组明显升高(P<0.001)。(2)细胞实验。与对照组相比,40、80、120、160、200μmol·L^(-1)FLC组TM4细胞活力明显下降(P<0.01);细胞凋亡率明显升高(P<0.05),40、80、160μmol·L^(-1)FLC染毒后细胞凋亡比例从对照组的5.7%分别提高至7.4%、9.4%、11.7%。Nrf2蛋白水平在40μmol·L^(-1)组明显升高(P<0.01),80、160μmol·L^(-1)组明显降低(P<0.01),HO-1蛋白水平在40、80、160μmol·L^(-1)组明显升高(P<0.01)。NQO1蛋白水平在40μmol·L^(-1)组明显升高(P<0.01)。NFκB蛋白水平在80、160μmol·L^(-1)组明显升高(P<0.001),IκBα蛋白在各染毒组均明显降低(P<0.001),各染毒组IKKβ蛋白无明显变化。[结论]FLC诱导睾丸组织凋亡,该过程中涉及Nrf2/HO-1信号通路和NFκB信号通路。体外研究验证FLC损伤TM4细胞活力诱导细胞凋亡,激活Nrf2/HO-1和NFκB信号通路。