基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析ERK的磷酸化

摘要

目的运用基于纳米技术的超微量蛋白免疫分析(Nanofluidic proteomic immunoassay,NIA)方法检测ERK的磷酸化。方法构建尾加压素Ⅱ(UrotensinⅡ)受体GPR14细胞系,UⅡ(10-7M)刺激该细胞系10分钟后,提取细胞蛋白采用传统Western方法和NIA技术分别检测同种样品ERK的磷酸化,并用两种方法观察UⅡ受体拮抗剂Urantide对ERK磷酸化的抑制作用。通过结扎C57BL/6小鼠冠状动脉左前降支,建立心梗模型,假手术组开胸不结扎,术后1周通过流式细胞术分离心脏侧群干细胞(Cardiac side population cells,CSPs),用NIA技术检测ERK磷酸化。结果 Western分析可观察到UⅡ介导ERK1/2的磷酸化,Urantide抑制该效应。NIA分析可观察到UⅡ介导ERK1/2磷酸化的多种异构体包括p-ERK1a,P-ERK1b,PP-ERK1,PP-ERK2水平升高,Urantide同样抑制该效应。心梗后CSPs数目明显增加。NIA分析显示,心梗促进CSPs上的p-ERK1b,PP-ERK1的水平升高,但对PP-ERK2影响不大。结论通过GPR14细胞系的分析,NIA技术灵敏度高,可检测ERK磷酸化的多种形式,运用该技术可检测数万个CSPs的ERK磷酸化,可观察心梗促进CSPs的某些ERK磷酸化异构体的水平升高,提示可能与心梗后CSPs的增殖有关。