PD-1蛋白促进肝纤维化大鼠Kupffer细胞分化的机制

摘要

目的探讨程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)蛋白促进肝纤维化大鼠Kupffer细胞(Kupffer cells,KCs)分化的机制。方法取SD大鼠10只,随机分为对照组和模型组,各5只。模型组大鼠皮下注射40%四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4):花生油1 ml/kg,每周2次,共计8周。对照组皮下注射等体积的花生油。第八周末处死大鼠,取出肝脏分别行苏木精-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色及Masson染色,验证肝纤维化模型造模成功。①分离培养各组KCs,流式细胞仪法检测KCs M0、M1和M2亚群所占的比例;免疫荧光法检测比较两组PD-1蛋白的表达水平。②将两组大鼠KCs分别转染PD-1 si-RNA,以western blot法检测转染前后各组KCs磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)的水平。结果 HE及Masson染色说明肝纤维化造模成功。模型组M1和M2比例增加,明显高于对照组。免疫荧光结果表明,模型组KCs PD-1蛋白表达显著高于对照组。Western blot表明4组间Akt与mTOR表达水平两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。与对照KCs-NC组相比,对照KCs-si-PD1组和模型KCs-si-PD1组的PD-1蛋白表达水平明显下降(P<0.01),PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显上升(P<0.05或0.01);模型KCs-NC组的PD-1蛋白表达水平明显上升(P<0.01),PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P<0.05或0.01)。与对照KCs-si-PD1组相比,模型KCs-NC组PD-1表达明显上升(P<0.01),PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平明显下降(P<0.01),模型KCs-si-PD1组PD-1蛋白表达水平明显上升(P<0.01)。与模型KCs-NC组相比,模型KCs-si-PD1组的PD-1蛋白表达水平明显下降(P<0.01),PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平上升(P<0.01)。结论 KCs PD-1蛋白表达的升高促进KCs的分化,引起肝的纤维化,其机制与PI3K下降,Akt、mTOR磷酸化水平降低,使PI3K/Akt/mTOR信号通路受到抑制有关。抑制PD-1基因表达可以升高Akt和mTOR磷酸化水平,激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制KCs的分化,或许可以抑制肝纤维化进程。