人APOBEC3H hap Ⅱ在昆虫表达系统中的表达及其纯化

摘要

目的构建重组人APOBEC3H hapⅡ(A3H hapⅡ)杆状病毒表达载体,在昆虫细胞表达系统中表达,表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化。方法采用PCR方法扩增A3H hapⅡ基因并加入His标签后,克隆至杆状病毒转移载体p Fast Bac1中,转化E.coli DH10Bac感受态细胞进行重组,构建质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His。将质粒转染昆虫细胞sf9获得P1病毒,扩增后获得P3病毒,感染sf9细胞表达目的蛋白,并进行Western blot鉴定。经Ni-NAT树脂亲和层析柱对表达的蛋白进行纯化,并通过免疫共沉淀试验检测A3H hapⅡ-His与其相互作用蛋白HIV-1 Vif之间的特异性结合。结果成功构建了质粒Bacmid-A3H hapⅡ-His;P3病毒感染sf9细胞后成功表达出相对分子质量约20 000的目的蛋白,且能够与HIV-1 Vif特异性结合。结论成功建立A3H hapⅡ昆虫表达体系,为进一步研究A3H hapⅡ与HIV-1 Vif之间的相互作用机制,并针对其相互作用位点设计抗HIV药物奠定了基础。