稀释液添加精氨酸对猪精子活力、一氧化氮合酶和一氧化氮含量的影响

摘要

试验旨在探讨39℃体外培养时,常温稀释液中添加不同浓度L-精氨酸(L-Arg)对猪精子活力、NO含量及一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的影响。首先根据已有专利和文献报道设计了3种稀释液配方:高糖+青霉素钠+硫酸链霉素(M+N组),高糖+庆大霉素硫酸盐(M+Q组),低糖+青霉素钠+链霉素(L+N组),并将商用稀释液设为对照组。使用稀释液重悬后,17℃恒温箱中孵育精子,每隔24 h测定一次活力指标。其次,取成年健康大约克公猪精液(精子活力>70%)离心重悬于自配精液稀释液,分别添加不同浓度L-Arg(0.0、0.5、1.0、2.0 mmol/L)置于39℃下孵育0、2、4 h,分别收集稀释液和精子,利用计算机辅助精子分析方法(computer-assisted sperm analysis,CASA)测定精子活力参数,评估精液稀释液中L-Arg的最适添加浓度。用最适浓度L-Arg处理猪精子,39℃孵育0、2、4 h,收集稀释液和精子,使用CASA分析测定精子活力参数,测定NO含量,利用蛋白免疫荧光定位方法测定精子中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(endotheliale nitric oxide synthase,eNOS)蛋白表达位置,并检测其酶活力,利用qPCR方法测定精子中iNOS mRNA表达水平,明确NOS在精子稀释和复温过程中不同时间点的变化特点。试验结果显示:1)与对照组相比,M+Q组可有效提高精子活力、向前运动比例、快速运动比例及原地摆动比例,降低精子不运动比例,保存效果相对较好。2)39℃体外培养精子2、4 h时,与对照组相比,精液稀释液中添加1 mmol/L和2 mmol/L L-Arg可显著提高精子细胞活力、向前运动比例、快速运动比例及慢速运动比例,显著降低精子原地摆动和不运动比例(P<0.05)。因此,选取1 mmol/L浓度的L-Arg进行后续研究。3)39℃孵育精子2、4 h时,和对照组相比,1.0 mmol/L L-Arg组NO含量呈升高趋势,总一氧化氮合酶(total nitric oxide synthase,TNOS)活力增强,iNOS酶活力显著增强(P<0.01)。试验结果显示,热孵育精子0、4 h时,L-Arg组精子细胞iNOS基因的相对表达显著高于对照组(P<0.01),iNOS和eNOS蛋白表达位置未发生改变。表明L-Arg可能通过减缓猪精子iNOS基因降解,增强NOS酶活力,促进NO的生成,维持精子活力。