兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养及相关鉴定分析

摘要

背景:从以往的文献来看,阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养存在着制作时间长,纯度不高以及易被成纤维细胞污染等诸多缺点。目的:探索兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养技术及纯度鉴定方法。设计、时间及地点:对照实验,于2007-10/2008-03在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科,上海市组织工程研究与开发中心完成。材料:成熟的雄性新西兰大白兔5只,体质量2.5～2.8kg。方法:取雄性新西兰兔新鲜的阴茎组织,利用高浓度的胶原酶消化法结合差速贴壁技术对海绵体平滑肌细胞进行纯化培养。以同期兔成纤维细胞作为对照参考。主要观察指标:以四甲基偶氮唑盐分析细胞生长特性;以平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞;以流式细胞仪检测P2及P5代细胞α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率变化情况。结果:培养细胞四甲基偶氮唑盐显示细胞指数增长期为6d左右,随后进入平台期。α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白均呈阳性反应,同期成纤维细胞仅α-肌动蛋白显示阳性结果。第2代细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率分别65.3%,42.2%,62.3%。经过反复多次的纯化技术至第5代时,上述指标阳性表达率分别上升为92.8%,72.7%,78.1%。结论:通过高浓度的酶消化法及差速贴壁技术可获得高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞,肌球蛋白、结蛋白相对于α-肌动蛋白可以成为鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标。