重组人PTP1B的原核高效表达及TFLC的体外抑制剂实验

摘要

目的 高效诱导表达并纯化具有活性的重组PTP1B融合蛋白(rhPTP1B),进行酶活性及抑制剂的实验.方法 重组体pGEX-hPTP1B转化E.coliDH5a,诱导表达rhPTP1B并优化条件后,超声取细胞裂解上清液经GST亲和层析柱纯化后,利用rhPTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐(pNPP-Na2)的磷酸基团而产生颜色反应来测定rhPTP1B活性,并分析其与rhPTP1B浓度、底物浓度及反应温度的关系,钒酸钠(Na3VO4)抑制类型的研究,老鹰茶总黄酮(TFLC)对rhPTP1B的抑制性作用和浓度依赖关系.结果 rhPTP1B表达的最适条件是在34℃和2.0 mmol/LIPTG下诱导表达10 h,可被GST亲和层析法分离纯化:其活性随酶浓度及底物浓度的增加而增加,35℃时rhPTP1B的活性最大;钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;TFLC对rhPTP1B有明显的抑制作用.结论 诱导表达纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究,TFLC对rhPT1B的强抑制作用可能是其降低糖尿病大鼠血糖浓度的机制之一.